1材料和方法

    1.1材料 永生化细胞系:HLEC-B3(中国医科大学眼科提供),HG-DMEM培养液购自美国Highclone公司,胎牛血清购自杭州四季青生物公司, pSNAV-TGF-β1质粒购于北京本元正阳基因技术有限公司，pEGFP-C2质粒中国医科大学微生物教研室提供，Lipofectamine2000购于Invitrogen公司,碘化丙啶（PI）购于Sigma公司，Triton-X-100购于BDH公司，CO2细胞培养孵箱(Heraeus)，超净工作台(Nuair)，低温高速离心机(Heraeus)，倒置显微镜( Olympus)。

    1.2方法 复苏时将冻存细胞系HLEC -B3从液氮罐中取出,快速放入37℃温水中溶解,溶化后以1 200/min离心约3～5min,离心半径为15cm。弃培养液后，放入含150mL/L胎牛血清，100mg/Ｌ青霉素及125mg/Ｌ链霉素的HG-DMEM培养基中,置于50mL/L CO2、37℃的细胞培养箱内培养。EcoR 和Sal 双酶切pSNAV-TGF-β1,回收插入片断（1.8kb），EcoR 和Sal 双酶切pEGFP-C2,回收线性载体(4.7kb)，连接上述二种回收的DNA，转化,筛选克隆，构建后的质粒命名为pEGFP- TGF-β1。基因转染前1d将细胞接种至6孔板,细胞密度为1×108个/Ｌ,在50mL/L CO2、37℃饱和湿度下培养24h，90%细胞达到融合;转染前使用PBS缓冲液冲洗细胞1次,更换不含抗生素的培养液。用无血清的HG-DMEM 250μL稀释pEGFP- TGF-β1 4μg，温和摇均。使用前轻轻混均Lipofectamine2000，然后将Lipofectamine2000 10μL加入无血清的HG-DMEM 250μL，混匀并于室温温育 5min。混合稀释的质粒和稀释的Lipofectamine2000，混匀，室温下放置20min。将质粒/ Lipofectamine2000复合物加入到6孔板的孔中，摇动培养板，轻轻混匀，在50mL/L CO2，37℃饱和湿度下培养，6h后更换含150mL/L胎牛血清的HG-DMEM培养基。将转染细胞,每日在倒置显微镜下观察并记录细胞的形态变化。接种HLEC- B3至6孔板,每孔5×103个细胞,培养过夜。实验组将pEGFP-TGF-β1转染细胞,对照组以150mL/L胎牛血清HG-DMEM代替。转染后24，48， 72，96h,分别消化收集细胞,计算细胞数量。每个时间点上设3个样本。

    1.2.1 HLEC- B3增殖的变化 采用MTT比色法。接种HLEC- B3至96孔板,每孔103个细胞、培养液100μL（不含抗生素）培养过夜。实验组为转染细胞（每孔加入质粒0.2μg, Lipofectamine2000 0.5μL）,对照组以150mL/L胎牛血清HG-DMEM代替,每孔50μL。转染后24，48，72，96h,加入5g/L MTT溶液,每孔20μL，37℃，4h。弃上清,每孔加入二甲基亚砜150μL,微量振荡器振荡10min,用酶标仪检测其在492nm处的吸光度(A 值)。每个时间点设6个样本。1.2.2细胞周期和凋亡的测定 实验组将pEGFP-TGF-β1转染HLEC-B3,对照组以等量含150mL/L胎牛血清HG-DMEM代替,24，48，72，96h后收集细胞,将细胞消化离心收集,经700mL/L冰乙醇固定,4℃保存过夜。使用前用pH值为7.4的PBS缓冲液冲洗3次,离心弃上清，加入10g/L RNA酶溶液1mL, 10g/L Triton-X-100溶液0.1mL, 37℃,温育10min，将细胞数调整至1×109个/Ｌ,取1mL细胞悬液;离心弃上清,加入PI溶液1mL，混匀后4℃避光染色20min。使用流式细胞仪检测。

    统计学处理：使用SPSS10. 0软件分析系统，两组间结果比较采用Student t 检验。

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