1.3 实验方法

    1.3.1 视网膜混合细胞的分离培养 分离视网膜，0.25%胰蛋白酶37℃下消化20min后终止，1000rpm离心5min，弃上清液，清洗3次，加入10%FBS的DMEM吹打混匀，调整细胞密度为1×10 6 /ml然后接种于96孔板，在37℃5%CO 2 饱和湿度培养箱内培养。

    1.3.2 不同浓度高糖对视网膜细胞的影响 在96 孔培养板中加入终浓度分别为30、60、120mmol/L葡萄糖，作用24、72、96h后，加MTT20μl（5mg/ml），37℃孵育4h后弃上清液，加入DMSO100μl，振荡10min，于酶联免疫测定仪550nm波长处测定A值。1.3.3 不同浓度高糖对视网膜细胞上清液中NO的影响 在24孔培养板中加入终浓度分别为30、60、120mmol/L葡萄糖，作用72h后，吸出各孔中上清100μl加入96孔细胞培养板中，一式三孔。并以DMEM液作空白对照。每孔加入新鲜配制的Griess液（将对氨基苯磺酰胺溶于10%的磷酸缓冲液中，配成20g/L的浓度。将所配液体避光存于4℃冰箱内。每次临用前将两者按体积比1:1配成Griess液）100μl。轻轻混匀，避光室温置10min后，用酶标仪检测每孔550nm处的吸光度（A 550  ）。

　　2 结果

    2.1 不同浓度葡萄糖对视网膜细胞增殖的影响见 表1。表1 不同浓度葡萄糖对视网膜细胞增殖的影响 （略）结果显示:60mmol/L葡萄糖与视网膜细胞培养24h，120mmol/L葡萄糖作用于视网膜细胞72、96h均可使吸光度值增加。

    2.2 不同浓度高糖对视网膜细胞上清中NO的影响 见表2。表2 不同浓度高糖72h后对视网膜细胞上清NO的影响（略）结果提示:60及120mmol/L葡萄糖培养72h，其上清中NO浓度较正常显著降低。

    3 讨论

高糖状态下，促使视网膜新生血管发生的条件持续存在，使新生血管形成持久非自限性发展。从结构上视网膜可分为10层，由众多种细胞组成，而这些细胞所组成的微环境对新生血管的发生应具有一定影响，以往的实验着重于单一成分细胞在高糖条件的表现，而忽略细胞间的相互作用。本实验以原代混合培养视网膜细胞作靶细胞，观察在高浓度葡萄糖环境下视网膜细胞的增殖状况。结果显示， 60mmol/L葡萄糖与视网膜细胞共培养24h，120mmol/L葡萄糖作用于视网膜细胞72、96h均可促进细胞增殖，30mmol/L葡萄糖则无此作用，可能只有较高浓度的葡萄糖才能促进视网膜某些细胞的生长。DR尤其是PDR发生时，不但有新生血管发生而且成纤维细胞、巨噬细胞、神经胶质细胞等也参与其形成，因而综合考虑多种细胞间的作用是非常必要的。NO在视网膜中的作用比较复杂，它对于不同的细胞有不同的反应性，而且在不同背景下即使是同样的细胞其作用也不同。对于混合培养的视网膜细胞，本实验证实高糖可使其NO分泌量减少或者是灭活增加，表现为浓度的降低。而且此时细胞表现为增殖，故我们初步认为其作用可能部分是通过NO来实现的。且有研究表明NO具有抑制多种细胞增生的作用 ［2］  。虽然此体外模型较成功地观察到高糖对视网膜细胞的促增殖作用，但在此条件下具体增生的是哪些细胞，而又有哪些种类的细胞未表现为增殖甚至是减少以及各细胞间相互作用的方式如何，都是以后将要探讨的问题。

　　参考文献

　　1 Michael Brownlee.Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications.Nature，2001，44:13.

    2 Mocada S，Palmer RMJ，Higgs EA.Nitric oxide:physiology，pathophysioloˉgy，and pharmacol.Rev，1991，43:109-142.

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