其中补充神经营养因子是视神经保护治疗中治疗效果比较肯定的一种方法。神经营养因子家族由神经生长因子（NGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）、神经营养素3（NT-3）、神经营养素4/5（NT-4/5）、睫状神经营养因子（CNTF）、胶质细胞源性神经营养因子（GDNTF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、胆碱能发育因子（CDF）等神经营养因子组成。这些因子和神经元的发育、存活密切相关，并有不同程度的抗凋亡作用。体内和体外实验均证明，有许多种神经营养因子对RGCs的发育、存活以及损伤后的修复起到重要作用。神经营养因子的剥夺是诱发青光眼RGCs凋亡的一个重要因素，外源性神经营养因子或内源性神经营养因子过度表达可以阻止容易受到损伤的RGCs发生凋亡。鉴于眼部的结构特点，采用全身给药方式，很难对RGCs产生预期的治疗效果，因此，需要经过玻璃体腔内注射神经生长因子，才会对RGCs起到保护作用。青光眼是一种慢性进展性疾病，病程漫长，需要终生进行视神经保护治疗。但玻璃体腔内注射神经生长因子仅能维持很短的时间，因此需要反复多次注射，存在诱发视网膜脱离、眼内炎等并发症的可能性，很难实际应用于临床治疗。为避免反复玻璃体腔内注射的并发症，我们考虑通过基因转染的方法，应用载体将神经营养因子的目的基因转染到RGCs和其他视网膜神经细胞，使其本身过度表达神经营养因子，从而改善其生长状态，起到视神经保护的作用。

     　基因治疗是指应用DNA 重组和基因转移技术，对基因进行改建、修饰和置换，或对异常基因的表达进行干预来治疗疾病的方法。青光眼的主要临床特征是视乳头和视野的改变，眼压升高是其中的一个重要危险因素。目前尚未发现青光眼是否具有某种特定基因改变，因而不可能通过矫正某个特定基因进行治疗。以RGCs为靶细胞的基因治疗方案直接针对青光眼视神经损害的最终共同通路，是治疗各种类型的青光眼的一个很有前景的研究方向。要达到预期的治疗目的，需要选择合适的载体和候选基因。因为在各种神经营养因子中，BDNF和NT4对RGCs的保护作用已经比较明确。我们拟选择这两种因子作为目的基因，对体外培养的RGCs进行转染，并评价其对细胞生长活性和功能的影响。

     　基因治疗的前提是外源基因能有效地进入组织细胞内，即基因转移，包括应用物理方法、化学方法和生物方法进行基因转移。生物学方法的基因转移主要以病毒作为媒介，包括腺病毒（Ad）、逆转录病毒（RV）、腺伴随病毒（AAV）、慢病毒和单纯疱疹病毒（HSV）等。病毒载体是眼科研究中最常用的基因转移方法，其中重组AAV具有无致病性、免疫原性弱和转染持续时间长的优点，是对神经元细胞转染很具前景的一种病毒载体。我们的研究选择AAV作为基因转移的载体。为此，我们首先评价了AAV载体对RGCs的转染效率和安全性。我们拟选择绿色荧光蛋白（GFP）基因作为报告基因，以AAV介导GFP基因转染体外培养的RGCs，判断AAV对RGCs的转染效率和安全性。

     　我们通过流式细胞学方法检测转染后细胞表达荧光的情况，细胞经rAAV-GFP转染后可合成绿色荧光蛋白（GFP），GFP可自发表达绿色荧光。通过对转染5天后的细胞进行流式细胞学检测，我们发现，随着转染倍数的增加，rAAV对RGCs的转染效率逐渐增加，而且开始出现绿色荧光表达的时间也提早。MOI达104时，RGCs的转染效率已达50％以上。我们应用的是二甲基噻唑二苯基四唑溴盐（MTT）比色法评价细胞生长活性，以此判断rAAV对RGCs的毒性。不同转染倍数转染的RGCs与未转染细胞的生长活性均无显著性差异。因此，可以认为rAAV对RGCs无明显毒性，是一种安全的载体。 在此基础上，我们应用AAV介导BDNF和NT4基因，转染RGCs，并判断目的基因在RGCs的表达和对RGCs生长状态的影响。我们的研究最终应用rAAV-BDNF对体外培养2天的RGCs进行转染，MOI＝105，继续培养7天。采用Trizol一步法提取转染细胞的总RNA。根据基因库中BDNF序列和AAV载体基因设计特异性引物，应用RT-PCR技术对外源性BDNF基因在RGCs细胞中mRNA水平的表达进行检测。分别在rAAV-BDNF转染7天和14天后收集细胞培养液，同时收集未转染细胞的培养液。应用ELISA方法对每组培养液中的BDNF含量进行检测。分别在转染后3天、6天和9天时，对rAAV-BDNF转染细胞、未转染细胞以及加入BDNF培养的细胞进行MTT比色分析，比较不同组的细胞生长活性。 应用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒和流式细胞仪，检测rAAV-BDNF转染细胞、未转染细胞以及加入BDNF培养的细胞的凋亡比率。结果发现，转染细胞可在基因水平和蛋白质水平表达外源性BDNF基因，而且，转染后的细胞的生长活性有所改善，发生凋亡的比率有所下降。应用同样的方法，评价了rAAV-NT4对RGCs转染的影响，结果与BDNF的转染是相似的。

     总之，我们的实验通过建立鼠RGCs的体外培养体系，评价了rAAV载体对体外RGCs转染的有效性和安全性，并进一步应用rAAV载体介导BDNF和NT4两种神经营养因子，转染体外培养的RGCs，证实转染后细胞在mRNA水平和蛋白质水平的表达，并且评价了转染后细胞活性和凋亡的改变。这些实验结果，为青光眼视神经保护的基因治疗提供了理论依据。

     青光眼的视神经保护治疗是一个很有前景的研究领域，基因治疗也是很有挑战性的研究，目前国内外许多学者在这方面进行了广泛的研究，必将会为实际临床应用带来新的治疗选择。

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