作者：王大江    作者单位：解放军总医院 眼科，全军眼科中心，北京 100853

    【摘要】  目的 研究小分子化合物J2对同种异基因小鼠角膜移植后植片RANTES基因表达的影响，从而探讨新型药物J2对于角膜移植排斥反应的作用机制。方法 建立小鼠角膜移植模型，随机分为A、B、C、D四组。A组为自体原位移植组，B、C、D组均采用C57BL/6-BALB/c同种异体角膜移植模型，术后采用腹腔注射给药，自手术当日开始，A组、B组给予安慰剂，C组给予CsA 10 mg/kg，D组给予J2 15 mg/kg，每天1次，连续给药12 d。观察各组植片生存指数变化，分别在术后第1周、第2周、第3周、第4周行RT-PCR检测角膜植片中RANTES基因的表达。结果 同种异体移植安慰剂组角膜植片平均存活时间为（18.87±4.19）d，J2组和CsA组发生排斥时间明显延迟，分别为（33.12±6.80）d和（35.13±5.74）d，与同种异体移植安慰剂组比较差异有显著性（P<0.01），但J2组与CsA组比较差异无显著性。在正常小鼠角膜未见RANTES基因表达。自体移植组RANTES基因在第1周均有少量表达，而其他3周没有显著表达；异基因移植组从第1周开始表达各种基因，第3周表达明显增强；而CsA组和J2组从第1周开始表达，第2、第3周表达减弱，第4周表达强于前3周。结论 RANTES基因参与了异基因小鼠角膜移植排斥反应，J2可以抑制其表达。

    【关键词】  化合物J2 角膜移植 RANTES

    角膜移植排斥反应是以细胞免疫为主、多种因素共同参与的复杂过程[1]，细胞因子网络与移植排斥反应的关系以及其影响移植物存活时间的机制一直是移植领域的研究热点。RANTES，又称激活正常T细胞表达和分泌的调节物(regulated on activation，normal T expressed and secreted)，是一种对T细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞特异的趋化因子。RANTES通过与相应受体结合而发挥生物学功能，主要对Th1、Th2细胞起作用，从而参与角膜移植排斥反应[2]。J2是一种基于CD4分子的立体空间构型，通过计算机辅助药物设计技术获得的非肽类小分子化合物，可以特异性阻断T细胞的CD4分子与主要组织相容性抗原（major histocompability complex， MHC）Ⅱ类分子β2 的结合[3]，经过部分体内和体外实验筛选，认为J2能够明显抑制T淋巴细胞激活并有良好的抗移植排斥作用[4-7]。本实验采用RT-PCR的方法动态观察小鼠角膜移植片中RANTES基因的表达情况，探讨J2抗角膜移植排斥的作用机制。

    1  材料和方法

    1.1  实验动物  124只清洁级BALB/c（H2d）小鼠作为受体，47只C57BL/6(H2b)小鼠作为供体，供、受体均为雌性，6～8周龄，18～22 g。所有受体BALB/c小鼠均为右眼接受角膜移植手术，供体C57BL/6小鼠双眼取材后过量麻醉处死。实验动物由解放军总医院实验动物中心提供（合格证号：SCSK（京）2002－0003）。

    1.2  实验药品  J2由军事医学科学院李松教授惠赠，环孢霉素A（Ciclosporin A，CsA，50 mg/ml，诺华制药厂），安慰剂为含0.5%DMSO的2%羧甲基纤维素，眼用平衡液（美国Alcon公司），11-0尼龙缝线（美国MONOSOF公司），限制性内切酶EcoR Ⅰ（大连宝生物公司），T4 DNA连接酶（大连宝生物公司），Taq DNA聚合酶（大连宝生物公司），DNA Marker DL 2000（美国Promega公司），Reverse Transcription System Kit（美国Invitrogen公司），Trizol（美国Invitrogen公司），M-MLV反转录酶（美国Invitrogen公司）。

    1.3  注射液配制  J2注射液的配制：用分析天平分别称取J2干粉15 mg，加入50 μl DMSO助溶，再分别加入灭菌2％羧甲基纤维素，震荡混匀，配制成1.5 mg/ml混悬溶液，室温避光保存备用。

    CsA注射液的配制：取50 mg/ml的CsA注射液，用灭菌生理盐水稀释成1 mg/ml的溶液，室温避光保存备用。

    1.4  动物分组及用药  采用随机数字法分组设计，124只随机分为4组，每组31只。A组为BALB/c小鼠自体原位角膜移植，B、C、D组均采用C57BL/6-BALB/c同种异体角膜移植模型，术后采用腹腔注射给药，自手术当日开始，A组、B组给予安慰剂，C组给予CsA 10 mg/kg，D组给予J2 15 mg/kg，每天1次，连续给药12 d。因术后并发症及意外死亡的鼠予以剔除，并予补齐。

    1.5  手术方法  术前准备：美多丽散瞳3次；用庆大霉素生理盐水冲洗右眼结膜囊。　术前用氯胺酮（5 mg/kg体重）、速眠新（2.5 mg/kg体重）腹腔注射麻醉， 散瞳，于受体右眼行穿透性角膜移植手术，植片、植床直径均2 mm，用11-0尼龙线间断缝合8或9针，线结暴露不埋藏，前房注入无菌空气恢复前房，庆大霉素冲洗结膜囊，10-0尼龙线缝合眼睑，外涂金霉素眼膏，术后24 h后剪开眼睑观察，有前房出血、感染、白内障、虹膜嵌顿者予以剔除，不计入统计，术后7 d拆除角膜缝线。

    1.6  观察排斥反应与判断的标准  　参照Sonoda等[8]的方法，术后14 d内每日手术显微镜下观察； 14 d后隔日观察1次，进行角膜混浊及新生血管指数评分，观察期为50 d。角膜混浊评分：0分，植片完全透明清亮；1分，植片轻度上皮性混浊；2分，植片混浊加重前基质混浊，虹膜纹理可见；3分，深层基质轻度混浊，虹膜纹理隐约可见；4分，深层基质中度混浊，仅可见瞳孔；5分，植片完全混浊，前房看不进。新生血管评分：0分，无新生血管；1分，植床周边有新生血管；2分，新生血管达植片周边部；3分，新生血管达植片中周部；4分，新生血管布满角膜植片。角膜植片排斥标准：以植片混浊评分和新生血管评分判定排斥，术后1周拆除角膜缝线后，角膜混浊减轻（一般混浊评分≤2），当角膜植片再次混浊加重，混浊评分≥3分，同时新生血管评分≥2分时即为排斥。

    记录每只眼出现排斥反应的时间，即角膜植片存活时间。统计各组植片存活时间进行数据分析。

    1.7  RT-PCR方法检测角膜移植术后角膜植片RANTES  每组随机选取20只小鼠，分别在术后第1、第2、第3、第4周每组中处死5只小鼠，即5只角膜提1个RNA标本做RT-PCR检测。断颈处死小鼠，立即摘除术眼眼球，取材时要求空气及手术器械消毒，避免棉絮、唾液等污染，手术显微镜下获取角膜，立即置于液氮中保存。提取小鼠角膜总RNA，根据Promega 公司的Reverse Transcription System Kit说明，建立总体积为20 μl的反转录反应体系。根据GenBank中已发表的基因的序列设计引物， 引物由上海生工生物技术有限公司合成，引物设计如下：RANTES引物：正义： 5′–GAAGGAACCGCCAAGTGT–3′，反义：5′–AGGACCGAGTGGGAGTAG–3′；β-actin对照引物：正义： 5′–ATA TCG CTG CGC TGG TCG TC–3′，反义：5′–AGG ATG GCG TGA GGG AGA GC–3′。

    RT-PCR反应条件：建立50 μl的RT-PCR反应体系：5 μl 10×Taq缓冲液；2 μl反转录反应产物（cDNA）；1 μl上游引物（25 μmol/L）；1 μl下游引物（25 μmol/L）；4 μl dNTPS(2.5 mmol/L)；0.5 μl Taq DNA 聚合酶（5 U/μl）；灭菌的蒸馏水36.5 μl，混匀离心，退火温度为58℃，26个循环，扩增长度为200 bp。扩增产物在2％琼脂糖凝胶中电泳观察结果，并用计算机凝胶成像系统提取图像，通过比较灰度值进行半定量分析。

    1.8  统计学方法  实验数据应用SPSS13.0统计软件进行分析处理。各组间植片存活时间差异采用One-Way ANOVO分析进行比较，两组之间比较采用SNK法。

    2  结果

    2.1  排斥反应的临床观察  术后第1周各组角膜均出现一过性混浊，当拆除角膜缝线后，各组有不同的表现：A组植片水肿逐渐消失，新生血管逐渐消失，在观察期内始终保持透明；B组新生血管不同程度消退，角膜植片混浊不同程度减轻，移植后第14天开始，新生血管再次加重并向植片生长，植片水肿、混浊加重，发生排斥反应；C组、D组植片水肿、混浊逐渐消失，植片透明，有一部分小鼠新生血管完全消退，有一部分小鼠新生血管部分消退，观察期内植片均发生排斥。

    2.2  各组角膜植片存活时间  应用单因素方差分析，各组间角膜植片存活时间差异有显著性（F=48.25，P＜0.01），然后利用SNK法分别进行各组间两两比较。其中B组与其他组间相比植片存活时间明显缩短，差异有显著性(B组与A组：q=16.98，P＜0.01;B组与C组：q=9.17，P＜0.01;B组与D组：q=8.33，P＜0.01)；C组与A组间差异有显著性(q=8.11，P＜0.01)、D组与A组间差异有显著性（q=8.93，P＜0.01）；C组与D组之间相比，植片存活时间差异无显著性（q=0.85，P=0.60）（见表1）。

    2.3  编码RANTES基因的变化 　结果如图1、图2：RT-PCR扩增编码RANTES基因长度约为200 bp。自体移植组RANTES基因在第1周少量表达，而其他3周没有显著表达；异基因移植组从第1周开始表达，第3周表达明显增强；而CsA组和J2组从第1周开始表达，第4周表达强于前3周。

    3  讨论

    角膜移植免疫是多种免疫细胞和免疫分子参与的复杂的免疫反应过程，近来研究表明细胞因子在角膜移植免疫中起重要作用。

    RANTES，又称激活正常T细胞表达和分泌的调节物(regulated on activation，normal T expressed and secreted)，是一种对T细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞特异的趋化因子。RANTES生物效应多种多样，无属特异性，人和小鼠的RANTES有90%的同源性[9]。RANTES为C-C类趋化蛋白，RANTES蛋白主要来源于活化的T淋巴细胞，T淋巴细胞激活后，RANTES蛋白质和mRNA水平都有上调。RANTES的主要作用是激活与调节正常T细胞的表达和分泌，在免疫应答中对单核细胞、T细胞、嗜酸性粒细胞起特异性趋化作用。RANTES与其受体结合可引起白细胞迁移，介导炎症反应的发生。研究显示[10]：RANTES主要是选择性引起CD4+ T细胞移动，在抗原激活T细胞之初，RANTES可以通过Th1和Th2细胞因子以及对T细胞共刺激分子和细胞因子受体选择性表达的诱导，而提高黏膜和体液中抗体反应，这些效应使之成为宿主和免疫最初反应的一个环节。近年来研究表明RANTES介导的细胞免疫在同种异体器官移植排斥反应中起重要作用，在肾、心脏、皮肤移植的标本中均检测到RANTES mRNA或RANTES蛋白的高表达。Mulligan等[11]用RNA免疫印迹分析法对大鼠同种异体心脏移植后移植物内RANTES mRNA进行检测，证明RANTES与同种异体心脏移植中炎性细胞向移植物浸润及排斥反应的发生密切相关。移植肾中RANTES mRNA表达升高，在浸润的单核细胞和肾小管上皮细胞检测出RANTES mRNA，提示RANTES是排斥反应发生的指示剂或促进剂[12]。Yamagami等[2]应用聚合RAN酶保护分析系统，检测出小鼠异基因角膜移植后角膜组织匀浆中RANTES基因的表达，认为与排斥反应有关。李莹等[13]的实验研究认为大鼠角膜上皮RANTES mRNA表达上调与角膜移植排斥反应特异性相关。RANTES不仅激活CD4+ T淋巴细胞，吸引NK细胞，加速NK细胞介导的细胞毒作用以及T细胞介导的特异性细胞免疫，而且还增强它们的细胞溶解反应，直接或间接介导免疫效应，使角膜植片失去功能。最新的实验研究表明，大鼠角膜损伤、角膜移植时缝线均会引起RANTES mRNA的表达增加，从而引起早期的角膜移植排斥反应[14]。

    本实验发现，自体移植组1～4周RANTES基因均没有显著表达；异基因移植组第1周开始表达，而第2周表达略有下降，第3周表达明显增强，之后表达又有所下降。我们认为第1周的少量表达可能与手术及缝线刺激有关，为非特异性炎症所导致。拆除缝线后表达有所下降，而到第3周角膜移植排斥反应发生时表达达到峰值，随着损伤修复表达量下降，这与我们所观察到的临床及病理指标基本吻合。而J2组第1、第2周少量表达可能也是非特异性炎症的表现，第3周的表达低于异基因移植组，而第4周表达强于前3周，说明J2阻断T细胞的CD4分子与MHC-Ⅱ类分子结合，阻碍了T细胞激活，推迟了排斥反应发生的时间，且其作用效果与CsA组基本相似，这与我们观察到的临床排斥时间和病理结果也是基本一致的。

    本实验将J2应用于眼科，从分子生物学方面观察其抗角膜移植术后免疫排斥反应的作用。J2与以往常规使用的免疫抑制剂不同，它主要是拮抗MHC-Ⅱ与CD4之间的相互作用，进而破坏CD4、TCR和其配体形成稳固的超级复合体，从而抑制T细胞活化，可能为抗移植排斥反应提供新的思路和用药靶点。

    【参考文献】

    [1] Niederkorn JY. Mechanisms of corneal graft rejection: the sixth annual thygeson lecture， presented at the ocular microbiology and immunology group meeting，October 21，2000[J]. Cornea， 2001,20(7):675-679.

    [2] Yamagami S， Miyazaki D， Ono SJ， et al. Differential chemokine gene expression in corneal transplant rejection[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，1999，40(12):2892-2897.

    [3] Song Li， Jimin Gao， Takashi Saton， et al. A computer screening approach to immunoglobulin superfamily structures and interactions: Discovery of small non-peptidic CD4 inhibitors as novel immunotherapeutics[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1997，94(1):73-78.

   [4] He Xiao， Jian-Nan Feng， Xin-hua He， et al. Potent inhibition of the CD4-dependent T cell response by J2， a novel nonpeptide organic ligand of CD4 D1[J]. Mol Immunol，2007， 44(5):784-795.

    [5] 张晗，黄一飞，王丽强，等. 小分子化合物J2在抑制小鼠角膜移植排斥反应中作用的初步研究[J]. 中华眼科杂志，2007，43(7):608-612.

    [6] 王大江，黄一飞，张晗，等. 小分子化合物J2对小鼠淋巴细胞的影响[J]. 解放军药学学报，2007，23(2):81-84.

    [7] 张晗，黄一飞，王丽强，等. 小分子免疫抑制剂J2抗移植排斥的实验研究[J]. 解放军药学学报，2006，22(2):115-118.

    [8] Sonoda Y, Streilein JW. Orthotopic corneal transplantation in mice：evidence that the immunogenetic rules of rejection do not apply[J]. Transplantation，1992，54(4):694-704.

    [9] 李莹，李维业. RANTES与角膜移植排斥反应有关的细胞因子 [J]. 国外医学 眼科学分册，2001，25(4):196-199.

    [10] Lillard JW， Boyaka PN， Taub DD， et al. RANTES potentiates antigen-specific mucosal immune responses[J]. J Immunol， 2001，166(1):162-169.

    [11] Mulligan MS， McDuffie JE， Shanley TP， et al. Role of RANTES in experimental cardiac allograft rejection[J]. Exp Mol Pathol，2000，69(3):167-174.

    [12] Grau V， Gemsa D， Steiniger B， et al. Time course of chemokine expression in acutely rejecting rat kidneys[J]. Transplant Proc，1999，31(3):1571.

    [13] 李莹，李维业，庞国祥，等. RANTES与SPARC基因在大鼠角膜移植排斥反应中的表达[J]. 眼科，2002，11(3):162-168.

    [14] Pillai RG， Beutelspacher SC， Larkin DF， et al. Upregulation of chemokine expression in murine cornea due to mechanical trauma or endotoxin[J]. Br J Ophthalmol，2008，92(2):259-264.