神经眼科             2152                                      PO0589

　　rhLEDGFp52基因原核表达载体的构建、诱导表达及蛋白纯化

　　赵海生  王一

　　第三军医大学西南眼科医院 400038

　　目的 构建rhLEDGF p52 基因原核表达载体，获得rhLEDGF p52蛋白。

　　方法 1利用基因重组技术将rhLEDGF p52 基因构建于原核表达载体pET30a(+)中，经酶切、测序鉴定构建结果。

　　2通过入终浓度为0.1mmol/ L、0.5mmol/ L、1mmol/ L、2mmol/ L、4mmol/ L的IPTG诱导30min 、1h、2h、3h、4h、5h、6h、24h，使其在大肠杆菌 BL21(DE3)中获得最佳表达。

　　3利用1:1000LEDGF抗体对rhLEDGF p52进行免疫蛋白印迹试验，鉴定诱导表达蛋白的特异性。

　　4通过Ni-NTA His.Bind.Resin方法进行纯化，以10 mmol/ L、50 mmol/ L、100 mmol/ L和150 mmol/ L终浓度的梯度咪唑洗脱液洗脱目的蛋白，使其获得最佳的纯化效果。

　　结果 1成功构建rhLEDGF p52 基因原核表达载体，酶切鉴定插入正确，插入序列经Invitrogen公司测序部分析，该序列与GenBank 中编码人的LEDGF p52 序列完全相同。

　　2在大肠杆菌 BL21(DE3)中获得表达（可溶性形式表达，表观分子量35kD 左右），以2mmol/ L 终浓度的IPTG诱导效果最好，在诱导后6h蛋白表达量最高，rhLEDGF p52蛋白表达量占菌体蛋白总量的34.63%。

　　3 Western Blotting 结果显示诱导后的上清中有能与抗LEDGF-单抗反应的蛋白,表观分子量35kD 左右,与目的蛋白的理论计算值相吻合,而诱导前的全菌中却没有条带出现，即rhLEDGF2蛋白能够特异性与 LEDGF-ab 结合。

　　4Ni-NTA His.Bind.Resin方法进行纯化，以50 mmol/ L终浓度的咪唑洗脱液洗脱目的蛋白的效果最佳，纯化后的rhLEDGF p52，终浓度达 520μg/ml，分析其纯度达87.93%。

　　结论 成功获得rhLEDGF p52蛋白，这为深入研究其生物学功能奠定了基础。

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