【摘要】 目的：通过观察在大鼠急性高眼压模型中视网膜一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase, NOS）分布及含量的变化，并检测视网膜丙二醛（malondialdehyde, MDA）水平的变化，探讨氨基胍（aminoguanidine, AG )与倍他洛尔（betaxolol）对大鼠高眼压视网膜缺血再灌注损伤的保护作用。
方法：采用前房穿刺加压法建立大鼠缺血再灌注损伤模型，维持灌注时间60min。将各组右眼球经视神经矢状切片标本做HE染色进行视网膜组织学观察，还原型尼克酰胺嘌呤二核苷酸磷酸黄递酶（NADPHd）法检测视网膜NOS染色阳性的细胞数，硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid, TBA）法测定各组左眼球视网膜MDA含量。
结果：各组视网膜均有NOS表达，NOS阳性细胞在视网膜主要分布于视网膜节细胞层（ganglion cell layer, GCL）、内丛状层（inner plexiform layer, IPL）、内核层（inner nuclear layer, INL），200倍视野计数生理盐水组视网膜GCL的NOS阳性细胞数明显高于空白对照组（P<0.01）；AG与betaxolol药物治疗各组的NOS阳性细胞数较生理盐水组减少（P<0.05）；视网膜NOS阳性细胞数与视网膜MDA含量增减呈正相关性(r=0.69,P<0.01)。
结论：AG通过对诱导型NOS的抑制在大鼠高眼压诱导视网膜损伤中起到视神经保护作用。betaxolol通过抑制钙通道，使NO的生成减少，增加抗氧化能力，从而起神经保护作用。
【关键词】 一氧化氮 氨基胍 倍他洛尔 高眼压 视网膜
0引言
倍他洛尔(betaxolol，商品名贝特舒)是一种高选择性β1受体阻滞剂，兼有Ca2＋通道阻滞作用，临床已用于降眼压治疗，关于倍他洛尔对青光眼患者具有视神经保护作用的研究，国内少有相关报道。氨基胍（aminoguanidine, AG）是iNOS的相对特异性抑制剂，Neufeld等[1]报道,在大鼠慢性青光眼模型中，AG能起到视神经保护作用，但对急性情况不明。我们利用前房加压法模拟青光眼制造大鼠视网膜缺血再灌注模型，选择NADPHd（还原型尼克酰胺嘌呤二核苷酸磷酸黄递酶）免疫组化的方法检测NOS活性，用以间接反映视网膜NO的水平，并检测视网膜MDA水平的变化，旨在探讨betaxolol与AG对大鼠高眼压视网膜缺血再灌注损伤的保护作用。
1材料和方法
1.1材料
健康成年SD大鼠2～3mo龄共27只，体质量180～220 g，无眼疾（外形正常，角膜透明），雌雄均有（南京医科大学实验动物中心提供，实验动物及条件符合国家科学技术委员会的《实验动物管理条例》）。随机分为空白对照组3只鼠，余24只大鼠施行高压前房灌注，维持时间60min。分别于高眼压60min后， 24只鼠分为高眼压生理盐水组、betaxolol治疗组、AG治疗组和betaxolol+AG联合治疗组，再根据再灌注时间的不同，又分为再灌注后1，7d组，每组3只6眼；2.5g/L倍他洛尔滴眼液(美国Alcon公司)，NADPHd（还原型尼克酰胺嘌呤二核苷酸磷酸黄递酶，Roche公司，美国），AG由北京理工大学亘元医药公司提供，NBT（硝基四氮唑蓝，Roche公司，美国），MDA试剂盒（南京建成生物化学试剂公司），Leica冰冻切片机及显微镜，Leica Qwin QG2232 V2.3图像分析处理系统。
1.2方法
动物模型的建立参照文献[2]，采用前房穿刺加压法建立大鼠缺血再灌注损伤模型。模型建立的观察：Healon针头置入大鼠前房，升高输液瓶高度至距大鼠眼的垂直距离136cm，此高度差可在大鼠眼内形成100mmHg的眼内压，维持灌注时间60min，施行前房高压灌注后，可观察到大鼠前房明显加深，用直接检眼镜观察大鼠眼底，以眼底视网膜动脉血流中断、球结膜苍白为视网膜缺血成功标准;，数分钟后可见角膜水肿呈雾状,灌注完毕拔除Healon针头后，穿刺口附近虹膜可见少量出血。丢弃穿刺口漏水，前房不能形成或前房明显积血或针头误伤晶状体，形成白内障的大鼠，重新补充实验大鼠。术后给予氯霉素眼液、红霉素眼膏预防感染。2.5g/L betaxolol眼药水在开始缺血前及灌注时点眼2次，此后每天2次(09∶00/10∶00和20∶00/21∶00)，每次1滴；AG用法为100mg/kg腹腔内注射，每日2次；联合治疗组用法同上。造模术后1，7d（每个时间点6只大鼠）分别用30g/L戊巴比妥30mg/kg,ip麻醉大鼠后，经左心室插管至主动脉快速灌注生理盐水100mL，再用40g/L多聚甲醛500mL维持灌注2～3h。术毕分别取眼球，于40g/L多聚甲醛中后固定2～3h后，置于300g/L蔗糖溶液中4℃过夜，待组织标本沉底后取出，经视神经做眼球的矢状切片，片厚30μm，隔2选2，置于0.01mol/LPBS（磷酸盐缓冲液，ph7.4）中待用。
1.2.1 NADPH黄递酶法检测NOS[3]
冰冻切片标本用0.01mol/L PBS重复漂洗3次，每次3min。然后置于孵育液中，在37℃温箱孵育60～90min。孵育液由0.6g/L NADPHd,0.6g/L NBT,3mL/L TritonX100和0.1mol/L PB（磷酸缓冲液，ph8.0）组成。染色完成后加入0.01mol/L PBS冲洗3次，每次3min，终止反应。常规脱水，中性树脂封片。
1.2.2 MDA含量的测定[4]
将上述各组对侧左眼球摘除后置于4℃冰生理盐水中，眼科小梁剪沿角巩膜缘后0.5～1mm剪除角膜，轻挤压弃去眼前节、晶状体及透明的玻璃体,用眼科显微镊夹住后部眼杯在液体平皿中涮一下，灰白色的视网膜就飘在液体中，剪短与视神经连接处得到灰白色的视网膜组织。硫代巴比妥酸（TBA）法测量MDA含量，测量方法和步骤严格按试剂盒说明书进行。
统计学处理:应用SPSS10.0版软件进行统计学分析。组间方差分析采用F检验，两两比较采用t检验。P<0.05为差异具有统计学意义，P<0.01为差异显著。
2结果
空白对照组视网膜分层清晰，各层结构没有明显异常。内外颗粒层细胞分布均匀、空隙少。高眼压非治疗组视网膜内外颗粒层明显肿胀，细胞排列紊乱密度低，外颗粒层感光细胞之间空隙增大，内颗粒层细胞分散、有大量空泡。药物治疗各组视网膜分层清晰，外颗粒层感光细胞有缺失，内颗粒层细胞分散偶见空泡（图1）。各组视网膜均有NOS表达，NOS阳性细胞在视网膜主要分布于GCL、IPL、INL，200倍视野计数生理盐水组视网膜GCL的NOS阳性细胞数高于空白对照组，在 1d组升高差异显著（t=20.02,P<0.01）；药物治疗各组的NOS阳性细胞数较生理盐水组减少，其中联合用药组较生理盐水组在1d时间点时比较减少差异显著（t=16.66,P<0.01），联合用药组较空白对照组在7d时间点时比较，NOS阳性细胞数减少无显著性差异（t=0.68,P>0.05）。高眼压生理盐水组MDA含量较空白组升高（t=2.60，P＜0.05），药物治疗各组的MDA含量较生理盐水组降低（表1），视网膜NOS阳性细胞数与视网膜MDA含量增减呈正相关性(r=0.69，P＜0.01)。表1 视网膜GCL NOS阳性细胞数及MDA含量（略）
3讨论
采用生理盐水高压前房灌注建立大鼠急性高眼压模型，这种模型制作方便、周期短、易重复并且眼压水平量化、调整方便，所造成的视网膜损伤以RGC首先受损，与青光眼的视神经损伤发生相仿，是研究高眼压早期视神经损伤的理想动物模型。国外有学者[1,5]采用兔前房内注射α－糜蛋白酶或用结扎涡静脉等方法用以升高眼内压模拟青光眼模型，也有将大鼠的小梁网用激光瘢痕化，增加房水循环阻力来升高眼内压，这些方法与人类青光眼的形成机制相似，但眼内压不易量化且不易控制试验过程，故一般较少采用。视网膜缺血再灌注后组织学变化与视网膜缺血的程度、持续的时间、不同的组织细胞及其所处的状态等因素有关，因此，研究结果存在差异。但是，视网膜缺血之后，随着再灌注时间的延长，其组织学变化常遵循一定的规律。一般来说，早期以水肿为主，晚期以细胞变性、萎缩及死亡为主。Takahashi等[6]研究发现,缺血再灌注7d以后，组织学的变化趋向于稳定，因此，人们将缺血再灌注1d和7d作为重要的时间点，研究此时的组织学变化[7]。NO是无机气体小分子，性质高度活泼，半哀期极短.仅为3～5 s，很难对其进行定位研究，一般以观察NOS的分布来确定NO的生成部位，以此来间接研究NO的有关作用，由于NADPHd组化染色经济、简便，所以人们常用NADPHd组化的方法研究NOS神经元的分布。丙二醛（MDA）是各类自由基攻击细胞膜中不饱和脂肪酸后形成的脂质过氧化稳定产物,通过测量MDA含量可以推测脂质过氧化反应强度和组织损伤的程度。
NOS在眼内含量丰富，体内存在3种由不同基因编码的异构体：nNOS,iNOS和eNOS (endothelial NOS)，其中nNOS和eNOS在生理条件下就能表达，其活性依赖于Ca2+和CaM（钙调蛋白）。我们发现，在空白对照组大鼠视网膜GCL、IPL和INL均有NOS表达，说明NO可能参与眼生理状态下的调节。高压灌注后的大鼠视网膜GCL变薄，升高眼压60min后各时间段检测NOS水平，发现视网膜的NOS表达相应增高。Liu等[8]在压力仓内人工培养视神经胶质细胞，增加细胞周围静水压至60mmHg，细胞内逐渐开始出现iNOS，24h后达高峰，并通过免疫组化及蛋白印迹法证实了iNOSmRNA的出现，提示直接给予压力也可诱导iNOS的产生。因此我们推测本论文中视网膜高表达的NOS可能主要为iNOS。由此产生的iNOS是一种仅在病理状态下才会表达的非钙离子依赖性酶，主要在视网膜缺血后期表达，iNOS的活性不依赖于Ca2+/CaM，其受创伤、缺血、内毒素、感染等因素诱导产生，参与机体的病理生理过程，作用缓慢而持久，iNOS RNA半衰期特别长，可持续长时间翻译合成 iNOS，由此产生 NO的量大，对视网膜组织的损伤也特别大[9]，因此研制高选择性、高效、低毒的 iNOS抑制剂对治疗缺血性视网膜疾病犹为重要。
大多数NOS抑制剂为非选择性抑制剂，可同时抑制3种NOS，不但抑制了具有病理作用的NOS的产生，同时抑制了具有生理作用的eNOS [10]。氨基胍是一种肼复合物，Corbett等于1992年首次报道了它具有高选择性抑制iNOS的作用，是近年研究较多的iNOS抑制剂，较非选择性NOS抑制剂NG硝基L精氨酸甲基酯（LNAME）对iNOS的抑制作用强7倍，并且AG对iNOS的抑制作用是持续的。AG抑制iNOS的机制是与其催化部位的血红素铁结合，抑制iNOS合成，阻断作为自由基的NO生成，降低NO的细胞毒性作用及其潜在的基因毒性，起到视网膜节细胞的保护作用[11]。我们发现，高眼压后AG治疗组NOS阳性细胞数较生理盐水组对照明显减少，反过来进一步证实了本实验中视网膜高表达的NOS主要为iNOS。有研究表明氨基胍对心、脑、肾及血压的影响很小，重要的是氨基胍本身对眼压无任何影响，所以AG作为高度选择性，高效低毒的iNOS抑制剂为缺血性视网膜疾病的治疗提供了新思路。
倍他洛尔（贝特舒， betaxolol）是一种β1肾上腺素受体拮抗剂，在眼部青光眼治疗中通过阻断睫状上皮β1肾上腺受体减少房水生成而降低眼压。在降眼压的同时它还可以抑制电压门控钙通道和NMDA受体门控钙通道，继而降低在缺血和损伤中引起的谷氨酸受体过度激活，以及之后的下游介质的激活、自由基形成、细胞凋亡而影响RGC的生物学功能，从而起神经保护作用[12,13]。为减少betaxolol对心、脑、血管的影响，本论文中betaxolol治疗组采用滴眼剂局部治疗，发现在药物干预1d视网膜NOS阳性细胞数较高眼压生理盐水组明显减少，而在7d减少较1d无明显差异（P>0.05），所以我们分析betaxolol可能在缺血再灌注早期通过阻断Ca2＋内流,减少Ca2＋依赖性nNOS的激活,使由nNOS催化的NO生成减少。我们还发现，视网膜MDA含量与视网膜NOS阳性细胞数的增减呈正相关性，这是由于NO本身可以作为自由基与超氧阴离子（O2）结合形成超氧亚硝根离子（ONOO），ONOO其共轭酸ONOOH可裂解生成氧化能力更强的OH，使生物膜不饱和脂肪酸发生过氧化反应，形成过氧化脂质（如MDA）。药物治疗各组MDA含量均明显低于高眼压模型后非治疗组，说明AG与Betaxolol均有抑制自由基的过多生成、减轻视网膜脂质过氧化反应的作用。
本论文结果显示，NOS阳性细胞数在联合应用betaxolol及AG组与高眼压生理盐水组比较NOS阳性细胞数减少差异显著(P<0.01)，而与空白对照组比较无统计学差异(P>0.05)，表明高眼压视网膜缺血再灌注后及时应用betaxolol与AG可使视网膜中NOS显著减少甚至恢复正常水平。由此可见，联合应用betaxolol与AG以减少不同时期不同类型NOS的表达,进而减少NO的产生及细胞毒性作用，可能有望成为治疗高眼压视网膜缺血再灌注损伤的有效措施，具体给药方式及剂量有待进一步探讨和研究。
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