【摘要】目的:通过高氧诱导的小鼠视网膜新生血管动物模型玻璃体内注入GM6001观察对视网膜PEDF表达的影响。
方法:选取鼠龄为7d的SPF级C57BL/6J小鼠48只(96眼),随机分为4组:正常组、高氧组、GM6001干预组和磷酸盐缓冲液对照组,每组12只。正常对照组鼠在正常空气环境中饲养,其余3组鼠置于氧箱中,建立高氧诱导的视网膜新生血管动物模型。在出生后第12d GM6001干预组幼鼠向玻璃体腔内注射GM6001 1μL(100μmol/L),而磷酸盐缓冲液对照组注射相同体积的磷酸盐缓冲液，正常组和高氧组不做处理。各组小鼠均在出生后第17d处死。摘除左眼球制作石蜡标本,分别用抗色素上皮衍生因子 (PEDF)和抗CD34抗体作免疫组织化学标记视网膜切片进行组织病理学观察；右眼剥离视网膜提取蛋白，采用ELISA法分析PEDF以及基质金属蛋白酶（MMPS）在视网膜中的含量。
结果:17d龄时，正常组和GM6001组小鼠在视网膜各层可见PEDF阳性表达产物，其中以神经节细胞层及神经纤维层表达为著，为高表达，对照组与高氧组小鼠，17d龄时表达显著减少，只在神经节细胞层有较高表达，其余各层表达极少见。MMP2，MMP9，PEDF的含量GM6001组和PBS对照组及高氧组之间在统计学上均有差异P＜0.01 GM6001组和正常组之间没有统计学差异P＞0.05，高氧组和PBS对照组没有统计学差异P＞0.05。
结论:玻璃体内注入一定剂量的GM6001通过抑制基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9能够有效增强高氧诱导下的小鼠视网膜PEDF的表达并使新生血管的增长受到抑制。
【关键词】 PEDF；MMP2；MMP9
A pilot study of MMP inhibitors on the pigment epitheliumderived factor in mouse retinal in a high oxygeninduced environment
ShaoFei Wang, Bing Ren, JiHua Guo, WenJing Li, XiaoWei Gao, FengLan Wang
Department of Ophthalmology, Medical College of Shihezi University, Shihezi 832002, Sinkiang Uyghur Autonomous Region, China; Ophthalmic Center, No.474 Hospital of Chinese PLA, Urumqi 830011, Sinkiang Uyghur Autonmous Region, China
Abstract
AIM: To observe the expression of pigment epitheliumderived factor (PEDF) in the retina of mice by high oxygeninduced retinal neovascularization with injecting GM6001 in vitreous cavity.
METHODS: Fortyeight C57BL/6J mice (96 eyes) aged 7 days in SPF were randomly divided into four groups: normal group, highoxygen group, GM6001 intervention group and phosphate buffer control group, with 12 mice in each. The normal group was fed in normal air, and the three groups were placed in oxygen boxes to establish high oxygeninduced retinal neovascularization animal models. at 12 days after birth, GM6001 intervention group was injected GM6001 1μL into the vitreous cavity, and phosphate buffer control group was injected with the same volume of phosphate buffer. No management was done on Normal or highoxygen groups. The mice were executed at 17 days after birth. Their left eyes were removed for specimens, and antiPEDF and antiCD34 antibodies were used respectively for immunohistochemical biopsy pathology observation. Retinal tissue protein was extracted from their right eyes to analyzing the content of MMP2, MMP9 and PEDF in the retina with ELISA.
RESULTS: In normal and GM6001 group, at 17dayold, PEDF positive expression was appeared in every retinal layer, especially in ganglion cells and nerve fiber layer. In highoxygen and control group, at 17dayold, PEDF expressed a significant reduction, only a higher expression in the ganglion cells and nerve fiber layer. At the remaining floors, the expression could rarely be seen. The expression of MMP2, MMP9 and PEDF was statistically significant in GM6001,PBS control and highoxygen group (P<0.01). That in GM6001 and normal group had no statistical signify (P>0.05). And in high-oxygen and PBS control group, the expression of MMP2, MMP9 and PEDF was not statistical significant (P>0.05)
CONCLUSION: In the oxygeninduced retinopathy in mice,injection of GM6001 1 μLl into the vitreous cavity can inhibit MMP2 and MMP9, effectively strengthen the expression of PEDF, and inhibit the growth of neovascularization.
KEYWORDS: pigment epitheliumderived factor; MMP2; MMP9
0引言
1989年，TombranTink等人从胎儿视网膜色素上皮细胞培养液中最初分离出PEDF，此后在人和鼠中克隆和纯化。PEDF属于丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor, Serpin)基因家族，但不具备抗蛋白酶活性。具有很强的抑制血管的作用，可能是维持角膜，玻璃体等眼内组织无血管形成的主要原因，在玻璃体内是主要的血管增生抑制剂。最近的研究表明MMP2和MMP9可以水解PEDF这为转录后PEDF的下降和低氧诱导的VEGF/PEDF比率的升高提供了一条新的解释。本研究通过高氧诱导的小鼠视网膜新生血管建立相对缺氧动物的模型。证明基质金属蛋白酶抑制剂通过抑制基质金属蛋白酶对色素上皮衍生因子的降解抑制高氧诱导的小鼠视网膜新生血管的形成。
1材料和方法
1.1材料 实验动物选取7d龄SPF级C57BL/6J新生小鼠48只，体质量3.5～4g, 经检查无眼疾,由新疆医科大学实验动物中心提供，雌雄不限，与母鼠一起饲养至适当日龄。实验分为正常组、高氧组、对照组及治疗组，每组12只。正常组:在正常空气环境下饲养10d,不做任何处理;高氧组:在高氧环境下饲养5d后在正常氧环境饲养5d,不注射药物;GM6001干预组:在高氧环境下饲养5d,行玻璃体腔内注射GM6001,后置于正常氧环境中饲养5d;对照组:在高氧环境下饲养5d,行玻璃体腔内注射磷酸盐缓冲液 (PBS),后置于正常氧环境下饲养5d。在出生后17d时，右眼剥离视网膜迅速置于液氮中，左眼摘除眼球做免疫组化。 所用设备：氧舱（自制）为40cm×30cm×20cm 玻璃制作的密闭容器，设有 2个圆形孔，一孔接 100%医用湿润氧气，控制阀可控制氧气流量，另一孔接氧气分析仪； Olympus OME手术显微镜（日本）；TOPCON PS11E裂隙灯显微镜（日本）；眼科显微手术器械（苏州六六视觉有限公司）；氧分压仪CYS1型：（上海市嘉定学联仪表厂）；LEICA RM 2135型切片机（德国）； 31G注射器 （自制）用橡胶线圈将最大刻度为5μL的注射器最小刻度为0.1μL的微量注射器和诺和灵R 31G针头连在一起。主要试剂：一抗羊抗人PEDF 多克隆抗体（Santer Cruze 公司，美国）；二抗生物素化兔抗羊多克隆抗体，免疫组织化学试剂盒（ 北京博奥森生物技术有限公司）；一抗鼠抗人CD34单克隆抗体（福州迈新生物技术有限公司）；二抗生物素化兔抗鼠多克隆抗体，免疫组织化学试剂盒（ 北京博奥森生物技术有限公司）；GM6001 (CHEMICON International，Inc．USA)；ELISA试剂盒购买于上海麦莎公司。
1.2方法
1.2.1 ROP小鼠模型制备 将7d龄新生小鼠连同哺乳母鼠一同置入密闭氧箱吸入高氧（75±5）％ 5d，再返回正常空气中饲养，制备新生小鼠视网膜病变模型。氧箱氧气浓度控制在（75±5）％ ，温度控制在(23±2)℃ ，每天更换垫料，添加饲料、水，母鼠每天拿出氧箱6h。
1.2.2实验步骤 治疗组小鼠腹腔注射氯胺酮(50mg/kg)麻醉，用美多丽散瞳，点表麻药，在立体显微镜下使微注射器针头透过结膜在鼻上或颞上象限距角膜缘处以40°～60°朝向赤道区刺入玻璃体腔，将注射器内的GM6001注入1μL（100μmol/L），并停留约1min后拔针。ELISA 动物麻醉后，摘除眼球，将眼球置于冰块上，在冷光显微镜下迅速剥离视网膜，迅速置于液氮中，然后放在80℃冰箱中保存备用。组织提取蛋白后，在酶标板上依照次序对应加入50μL的标准品于空白微孔中；分别标记样品编号，加入50μL样品于空白微孔中；在样品孔中加入10μL的生物素标记液；在标准品孔和样品孔中加入50μL的酶标记溶液；(36±2)℃孵育反应60min；洗板机清洗5次，每次静置10～20s；每孔加入底物A、B液各50μL；(36±2)℃孵育反应15min；每孔加入50μL终止液，终止反应；在波长450nm的酶标仪上读取各孔OD值；以OD值的对数值为纵坐标，以标准品对数值为横坐标绘制双对数曲线，并求出公式，根据求得的OD值的对数值求出相应的样品浓度。
1.2.3 PEDF免疫组织化学检测 石蜡切片常规切片至水，EDTATRIS缓冲液（pH值9.0），高压抗原修复10min[1]，30mL/L过氧化氢室温抚育10min,PBS溶液浸洗后加入200g/L兔血清封闭10min，滴加PEDF(工作浓度为1∶50)一抗工作液4℃过夜，滴加生物素标记兔抗羊IgG二抗37℃ 30min,链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物（streptavidinbiotin peroxidase complex,SABC）37℃ 30min，DAB显色，苏木素复染后封片。
1.2.4 CD34免疫组织化学检测 按试剂盒说明进行石蜡切片常规切片至水，EDTATRIS缓冲液（pH值9.0），高压抗原修复10min，30mL/L过氧化氢室温抚育10min,PBS溶液浸洗后加入200g/L兔血清封闭10min，滴加CD34(工作浓度为1∶400)一抗工作液4℃过夜，滴加生物素标记兔抗羊IgG二抗37℃ 30min,链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物（streptavidinbiotin peroxidase complex,SABC）37℃ 30min，DAB显色，苏木素复染后封片。
统计学处理：使用SPSS 13.0 for windows软件对所有数据进行统计学分析。各组间均数比较，组间两两比较均采用方差分析。P<0.05认为差异有统计学意义。
2结果
视网膜组织切片HE染色 正常组未见明显的突破内界膜的血管内皮细胞细胞核（图1）;高氧组和对照组则显著增多,有的形成新生血管芽,有的形成新生血管团（图2，3）;GM6001干预组突破内界膜的血管内皮细胞细胞核明显减少（图4）。
2.1免疫组织化学检测结果 PEDF阳性表达产物成棕黄色，小鼠视网膜各层可见阳性表达，其中以神经节细胞层及神经纤维层表达为著，正常组小鼠为高表达（图5），高氧17d龄时表达显著减少，只在神经节细胞层、神经纤维层有较高表达，其余各层表达极少（图6）。对照组与高氧组相似（图7）。GM6001组，在17d龄时仍为高表达，显著高于高氧组和对照组（图8）。CD34阳性表达产物成棕黄色,正常组未见明显的突破内界膜的血管内皮细胞（图9），高氧组和对照组见大量突破内界膜的血管内皮细胞（图10，11）；GM6001干预组见少量突破内界膜的血管内皮细胞（图12）。生后第17d正常组、高氧组、GM6001干预组及磷酸盐缓冲液对照组平均每只眼球突破内界膜的血管内皮细胞细胞数分别为(0.33±0.19)个、(36.00±5.62)个、(4.58±0.47)个、(36.50±4.15)个,组间比较,差异有统计学意义(F=355.03,P<0.05),其中高氧组与正常组、GM6001干预组相比,差异有统计学意义(P<0.01);GM6001干预组与磷酸盐缓冲液对照组相比,差异亦有统计学意义(P<0.01); GM6001干预组与正常组相比,差异亦有统计学意义(P<0.01);磷酸盐缓冲液对照组与高氧组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。
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