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2结果
2.1免疫组化染色结果 免疫组化MMP9、TIMP1、蛋白均主要表达于视网膜内外网状层、视锥视杆层、神经纤维层。MMP9在正常对照组微弱表达，呈淡黄色颗粒状。MMP9在外伤性PVR组1d显著表达，呈棕黄色颗粒状，随着病程的延长，MMP9的表达呈减弱的趋势; MMP9在外伤后应用GM6001各个亚组均微弱表达。TIMP1在正常对照组中等表达，在外伤性PVR与外伤后应用GM6001各个亚组均有明显表达(图1AE)。
2.2免疫组化计算机图像分析结果 平均灰度值越低，说明免疫组化信号越强，相应的阳性表达越高。
2.2.1 MMP9的测定 外伤后1，3，7d，外伤性PVR组MMP9表达的平均灰度值均明显低于正常对照组（P<0.01）；外伤后应用GM6001组MMP9表达的平均灰度值均明显高于外伤性PVR组（P<0.01），但与正常对照组的差异均无显著性。外伤后1，3，7d，外伤性PVR组MMP9表达的平均灰度值呈增高趋势。外伤后14，21，28d，外伤性PVR组与正常对照组MMP9表达的平均灰度值的差异均无显著性。外伤后应用GM6001组与外伤性PVR组MMP9表达的平均灰度值的差异均无显著性，与正常对照组MMP9表达的平均灰度值的差异也均无显著性（图2）。
2.2.2 TIMP1的测定 外伤后各个亚组，外伤性PVR组TIMP1表达的平均灰度值均明显低于正常对照组（P<0.01）；外伤后应用GM6001组TIMP1表达的平均灰度值均明显低于正常对照组（P<0.01），但与外伤性PVR组的差异无显著性（图3）。
图1 免疫组化染色结果（免疫组织化学SP法，DAB染色，苏木素复染，×40） A：PBS阴性对照；B：正常对照组视网膜组织中TIMP1的表达；C：外伤性PVR组1d视网膜组织中MMP9的表达；D：外伤性PVR组3d视网膜组织中MMP9的表达；E：外伤后应用GM6001组1d视网膜组织中TIMP1的表达（略）
图2 MMP9在大鼠视网膜表达的平均灰度值 bP<0.01外伤性PVR组、外伤后应用GM6001组 vs正常对照组；dP<0.01外伤后应用GM6001组 vs外伤性PVR组（略）
图3 TIMP1在大鼠视网膜表达的平均灰度值 外伤性PVR组、外伤后应用GM6001组 vs正常对照组均有P<0.01（略）
2.2.3 MMP9/TIMP1的测定 对MMP9/TIMP1平均灰度值比值进行单因素方差分析结果见表1。若MMP9/TIMP1平均灰度值比值降低，则表明MMP9/TIMP1比率增高，反之则MMP9/TIMP1比率降低。外伤后1,3,7d，外伤性PVR组MMP9/TIMP1的平均灰度值比值均明显低于正常对照组（P<0.05）；外伤后应用GM6001组MMP9/TIMP1的平均灰度值比值均明显高于外伤性PVR组和正常对照组（P<0.01）；外伤后14,21,28d，外伤性PVR组和外伤后应用GM6001组MMP9/TIMP1的平均灰度值比值均明显高于正常对照组（P<0.01）；但外伤性PVR组和外伤后应用GM6001组之间的差异无显著性。外伤后1,3,7d，外伤性PVR组MMP9/TIMP1比率增高。
3讨论
外伤性PVR是指严重眼球穿通伤和眼内异物伤后，由于视网膜色素上皮细胞、神经胶质细胞、成纤维细胞、巨噬细胞的迁移、增生、转分化和收缩，在视网膜前、后面及玻璃体内形成的可以收缩的细胞性膜，造成牵拉性视网膜脱离。GM6001，又名Galardin或Ilomastat,是一种新型的人工合成MMPs抑制剂，被认为是目前人工合成的TIMPs中抑制作用最强的药物。GM6001抑制MMPs活性的作用机制是结合酶分子中的底物识别部位，并在酶的活性中，与催化所需的Zn2+络合，抑制其活性。GM6001可明显抑制各种MMPs的活性，主要是MMP2和MMP9，其抑制作用随着剂量的增加而增大。近十年来，ECM在增殖性疾病中的重要作用也日益受到重视，Ioachim等[1]在PVR视网膜前膜ECM免疫组化研究中发现ECM成分在PVR发病过程中起关键作用，引导细胞迁移，调节细胞生长、分化，增加对细胞因子的敏感性，相互反复发挥协同作用，促进、导致PVR视网膜前膜的形成与发展。
MMPs家族包括多个结构相似、能够消化基质和基膜的酶,目前已知至少有26 种MMPs 家族成员。根据结构域及酶与底物亲和力的不同，将MMPs 分为5组：(1) 胶原酶：包括MMP1、MMP8、MMP13、MMP18，主要作用于间质胶原；(2)明胶酶：即明胶酶A(MMP2)和明胶酶B(MMP9)，具有降解基底膜IV、V、VII、X型胶原、明胶和其它蛋白（纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白）的活性；(3) 基质溶解素：包括MMP3、MMP7、MMP10、MMP11，可特异性降解蛋白多糖、纤维连接蛋白、层粘连蛋白；(4) 弹性蛋白酶，即MMP12，降解天然弹性蛋白；（5） 膜型MMP：现已发现4种，即MT1MMP、MT2MMP、MT3MMP、MT4MMP，能激活proMMP2和水解消化纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、纤维结合蛋白、纤维结合素和纤维蛋白[2]。
越来越多的研究表明[3,4],由于外伤、视网膜裂孔形成、长期视网膜脱离或手术时冷凝、光凝、电凝，导致组织损伤，血管受损，血视网膜、血房水屏障破坏，血清中的各种生长因子如肝细胞生长因子，转化生长因子进入眼球内，激活尿激酶和组织型纤维蛋白溶酶原，进而激活纤溶酶，通过启动瀑布式酶联激活反应使大量的MMPs酶原激活，活化的MMPs再进一步激活其他MMPs成员。Liou等[3]向视网膜裂孔注射白介素1β，术后12h检测到MMP2和MMP9，24h达到高峰，正好与肝细胞生长因子受体磷酸化最高峰相吻合，表明视网膜裂孔和IL1β激活肝细胞生长因子，活化的蛋白激酶激活MAPK，cjun，以及ECM重建，导致创伤视网膜中细胞的迁移和增生。此外，血液中的单核细胞趋化蛋白1、血小板源性生长因子、成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子及炎症产生的炎症因子如肿瘤坏死因子、白介素1a通过刺激原癌基因 cfos、cjun表达从而促进MMPs的大量转录。我们也在研究中发现：向大鼠玻璃体腔内、视盘前方注入PRP血浆后，引起MMP2和MMP9的大量表达。其具体表达情况：外伤后1d，外伤性PVR组MMP9的表达最强，外伤后3,7d MMP9的表达也增强，但呈进行性减弱的趋势；MMPs破坏由细胞间基质及基膜构成的ECM屏障，MMP2和MMP9是Ⅳ型胶质酶的两个亚型，分子量分别为72kDa、92kDa,活化后可降解基底膜IV、V、VII、X型胶原和明胶蛋白、粘连蛋白及弹性蛋白等成份，直接破坏ECM屏障，促使细胞发生转移。MMP9可促进炎症反应及组织损伤，TIMP1抑制MMP9活性，促进组织修复[5]。
表1 MMP9/TIMP1平均灰度值比（略）
aP<0.05,bP<0.01外伤性PVR组、外伤后应用GM6001组 vs正常对照组；dP<0.01外伤后应用GM6001组 vs外伤性PVR组
【参考文献】
1 Ioachim E, Stefaniotou M, Gorezis S, et al. Immunohistochemical study of extracellular matrix components in epiretinal membranes of vitreoproliferative retinopathy and proliferative diabetic retinopathy. Eur J Ophthalmol 2005;15(3):384391
2 Zhang XJ, Ren B, Gao XW. Gurrent advances about the mechanism of PVR correlated with MMPs/TIMP. Int J Ophthalmol(Guoji Yanke Zazhi) 2008;8(3):575577
3 Liou GI, Pakalnis VA, Matragoon S, et al. HGF regulation of RPE proliferation in an IL1beta/retinal holeinduced rabbit model of PVR. Mol Vis 2002;20(8):494501
4徐国兴,胡建章,郑卫东,等.基质金属蛋白酶2、金属蛋白酶2组织抑制因子及转化生长因子β1在糖尿病性白内障晶状体上皮细胞的表达及其意义.中华眼科杂志2003；39（3）:411
5 Enver O, Yoshiyaki K, Hiroshi O, et al. Role of matrix metalloproteinase9 in the basement membrane destruction of superficial urothelial carcinomas. J Urol 1999;161(4):13591363 上一页 [1] [2] |
