作者：高军,施彩虹，朱鸿
作者单位：(201900)中国上海市，上海交通大学医学院附属第三人民医院眼科
【摘要】糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy, DR）是世界性致盲眼病之一，其发病机制尚不完全清楚。促红细胞生成素（erythropoietin, EPO）是新发现的独立的潜在的糖尿病视网膜病变的血管源性因子。而EPO在DR发病中所起的作用，在不同研究中有不同的表现。本文就EPO/EPOR系统在DR中的表达与DR病变发病的关系研究以及EPO治疗DR的相关研究进展进行综述。
【关键词】 糖尿病视网膜病变 促红细胞生成素 EPO受体
Relationship between EPO/EPO receptor system and diabetic retinopathy
Jun Gao, CaiHong Shi, Hong Zhu
Foundation items:Shanghai Education Commission of Oustanding Young teacher in Special fund (No. jdy07070); Science and Technology Foundation of the Medical Coolege of Shanghai Jiaotong Univercity (No. 2008XJ029)
Department of Ophthalmology, the Third Affiliated Peoples Hospital, School of Medicine of Shanghai Jiaotong University, Shanghai 201900, China
Abstract
An apparent epidemic of diabetes is occurring in adults worldwide. The population of developing countries and some communities within developing countries are at higher risk. The pathogenesis of diabetic retinopathy is not clear now. Erythropoietin（EPO）as a retinal angiogenic factor in diabetic retinopathy is newly found. Recent researches have indicated that EPO/EPOR system plays an importance role in diabetic retinopathy. Here we reviewed the expression of EPO and its receptors in DR and investigated the relationship between EPO /EPOR system and DR.
KEYWORDS: diabetic retinopathy; erythropoietin; erythropoietin receptor
0引言
糖尿病性视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最常见和最为严重的并发症之一。DR的早期诊断和治疗也成为当前研究的热点，如对血浆ET1的研究显示，其血浆浓度的表达可协助诊断DR[1]。糖尿病视网膜病变的特征改变是视网膜微循环障碍。早期DR的病理改变为毛细血管内皮细胞的基底膜增厚，周细胞丧失，血视网膜屏障破坏，微血管瘤形成，毛细血管闭塞。晚期由于广泛的视网膜缺血、缺氧，引起视网膜水肿，新生血管形成和纤维组织增生。糖尿病最终如何导致DR的发病的机制十分复杂，目前认为多种因素相互作用引起视网膜新生血管形成和血视网膜屏障（bloodretinal barrier，BRB）破坏在DR的发生和发展中起着关键作用。长期的高血糖导致氧化酶损伤，微血栓形成，细胞黏附分子活化、白细胞郁积和细胞因子活化，继之，缺氧调节的生长因子的表达增加和细胞因子的产生。在这个机制中起主要作用的因子为VEGF、IGF1、TNFα、IL1β、FGF等。多种因子相互作用引起视网膜新生血管形成和BRB破坏[2]。以往研究中，DR和其他缺血性视网膜疾病中VEGF已被认为是引起BRB破坏的主要原因。而其它一些血管渗透性因子通过VEGF间接起作用[3,4]。但最新有研究表明EPO和VEGF和增殖性DR（PDR）的联系是各自独立的，且EPO与PDR的联系性比VEGF更强[5]。
2促红细胞生成素/促红细胞生成素受体系统
2.1促红细胞生成素 红细胞生成素（erythropoietin, EPO）是一种糖蛋白激素，分子量约34kDa。血浆中存在的EPO由165个氨基酸组成。天然存在的EPO分为两种类型，α型和β型。两种类型的EPO在生物学特性、抗原性及临床应用效果上均相同[6]。人类EPO基因位于7号染色体长22区。1985年其cDNA被成功克隆，并利用基因重组技术开始大批量生产重组人促红细胞生成素（recombinant human erythropoietin, rHuEPO），广泛用于临床。EPO合成的调节：缺氧是肾脏分泌EPO的主要刺激因素。离体灌注肾脏中EPOmRNA表达和EPO分泌受到灌注液中氧浓度调控[7]，故机体主要通过肾内细胞感知血氧的变化来系统调控EPO的合成。EPO的合成通过低氧诱导因子（hypoxiainducible factor, HIF）调控，HIF由一个β亚单位和一个α亚单位组成（HIF1α或HIF2α）[8]。传统认识中，EPO是一种作用于骨髓造血细胞，促进红系祖细胞增生、分化，最终成熟的内分泌激素。对机体供氧状况发挥重要的调控作用。在胚胎早期，EPO由肝生成，然后逐渐向肾转移，出生后主要由肾小管间质细胞分泌。过去EPO主要用于治疗贫血。但近年来研究表明，EPO也是一种参与中枢神经包括视网膜损伤反应的重要介质，参与机体多种功能的调节。这些功能主要有：对红细胞容量的精细调节；在脑缺血时的神经元保护作用；神经元增生作用；促进神经系发育；保护红细胞膜；促进肠黏膜发育；增强放疗敏感性；增加促性腺激素、改善性功能以及对女性生殖系统的作用等[9]。
2.2促红细胞生成素受体 人的促红细胞生成素受体（erythropoietin receptor, EPOR）是细胞因子受体超家族的一员，由507个氨基酸组成。基因位于19号染色体短臂24区，长约5～6.5kb。EPOR结构可分为三部分：细胞外部分，跨膜区域，胞质部分，胞质部分缺少酪氨酸激酶的特征排列顺序，所以不具有酪氨酸激酶活性。1990年樊华等[10]的研究结果证实EPOR是通过与配体结合形成二聚体化而被活化的，目前认为EPOR只是一种亚单位，在EPO的作用下，形成同源二聚体。EPOR介导的信号传导系统中，JAK/STAT途径起着重要作用，是通过JAK2，STAT5传导信号的[11]。除JAK/STAT途径外，EPOR的信息传递也涉及Ras/MAP途径[12]。
2.3 EPO/EPOR在眼内的表达 GarcíaRamírez等[13]的研究表明：在非糖尿病组中Epo和EpoR mRNAs 在视网膜色素上皮层（RPE）的表达要显著高于在视网膜神经细胞层的表达.在糖尿病组的视网膜中EPO呈现高表达（视网膜色素上皮层和视网膜神经细胞层均有高表达）。EpoR的表达也呈现类似的结果. 玻璃体内的EPO和EPOR在糖尿病组中的表达要高于非糖尿病组。
3促红细胞生成素（EPO）/EPOR系统与糖尿病视网膜病变
促红细胞生成素（EPO）/EPOR系统与视网膜的发育形成及病变有着密切的关系[14]。Patel等[15]的研究表明：EPO对胎儿视网膜的发育和形成起重要的作用。随着妊娠期的增加，胎儿玻璃体和血清中的EPO蛋白也随之增加，且相同的妊娠期的胎儿EPO mRNA和蛋白在玻璃体中的表达要比血清中的表达高很多促红细胞生成素。EPO/EPOR系统与糖尿病视网膜病变相关。有研究表明在增殖性糖尿病视网膜病（PDR）患者的眼玻璃体中的EPO浓度较普通人有显著的提高[16]。且EPO/EPOR系统与不同阶段的糖尿病视网膜病变均有着密切的联系。有研究显示[17]：早期糖尿病大鼠的视网膜中可见EPOR呈大量强阳性表达。凋亡是早期DR视网膜神经元细胞死亡的主要方式。而视网膜中EPOR的大量表达也许是对视网膜细胞和组织在糖尿病应激时的一种补偿反应。EPO/EPOR系统就像一个视网膜神经细胞在对早期糖尿病的刺激时的保护和存活系统。同时，Watanabe等[5]的研究表明：EPO是增殖性DR（PDR）即晚期DR的一个潜在的血管源性因子，而且EPO和VEGF和增殖性DR（PDR）的联系是各自独立的，且EPO与PDR的联系性比VEGF更强。另外，Jonas等[18]的研究显示：EPO在糖尿病黄斑水肿的眼内的表达要比年龄相关性黄斑变性及普通正常眼内的表达有显著的提高。Hernández等[19]的试验结果给出了相似的提示。以上试验均提示EPO/EPOR系统与糖尿病视网膜病变的密切联系。
3.1促红细胞生成素（EPO）/EPOR系统与糖尿病视网膜病变时视网膜神经病变的关系 有动物试验显示外源性促红细胞生成素（EPO）对脑缺血、脊髓束或外周神经损伤、自身免疫性脑脊髓炎等多种神经系统损伤有保护作用[20]。视网膜作为中枢神经系统的外延部分，EPO同样参与了缺血的视网膜神经元的保护。Grimm等[21]证明在鼠腹腔内注入rhEPO能保护光诱导的视网膜变性的视网膜神经细胞。Bianchi等[22]进一步证实EPO还能预防甚至逆转大鼠糖尿病神经病变，为防治糖尿病视网膜病的神经细胞的凋亡开拓了新的思路。有动物试验显示[17]：正常大鼠视网膜中可见EPOR弱阳性表达，主要位于视网膜内层，包括视网膜节细胞层和内核细胞层。而糖尿病大鼠的视网膜中可见EPOR呈大量强阳性表达，同时视网膜超微结构也发生了神经节细胞的异常；而在同期腹腔注射EPO的糖尿病大鼠视网膜中仅见EPOR弱阳性，并且没有发现明显的视网膜超微结构异常。因此可以认为EPOR表达的强弱与视网膜神经节细胞超微结构的改变存在某种联系，即由于视网膜缺血缺氧后视网膜上的EPOR表达增加，但却没有与之相结合的EPO的增加，因此EPOR无法激活产生一系列的抗凋亡作用而加剧了视网膜的缺血缺氧。EPO对糖尿病性视网膜病变时视网膜神经细胞的保护作用的可能机制有： EPO可以从多方面阻断糖尿病神经病变。EPO可以减轻缺血过程中的炎症反应[23]，发挥神经保护作用。另外，体内及体外试验均证明EPO还可以促进血管生成，增加神经血供，促进神经功能的恢复[24]。更重要的是，研究已证明EPO可防止后根神经节的神经元细胞的凋亡。这一作用依赖于蛋白酪氨酸磷酸激酶（JAK2）级联信号转导途径的激活[25]。EPO与神经元上的EPO受体结合，激活JAK2，使其磷酸化，进一步介导下游的信号转导。使用JAK2抑制剂AG490可以显著减弱EPO的神经保护作用。磷酸化的JAK2可以通过两条信号转导通路—磷酸肌醇3激酶（PI3K）Akt通路、核因子kB（NFkB）通路—最终实现其抑制凋亡的作用。
3.2促红细胞生成素（EPO）/EPOR系统与糖尿病视网膜病变时视网膜新生血管 新生血管形成是指新生血管从已存在的血管向无血管区域延伸的过程，包括血管基底膜降解、内皮细胞增殖、迁移以及迁移细胞排列形成管道。新生血管形成是一个复杂的动态发展过程[26]。新生血管形成是糖尿病视网膜病变的关键步骤。俞梅等[27]的研究表明：在宫颈病变中EPOR表达强度及微血管密度随病变级别升高而增加，并且二者之间呈显著正相关，提示EPOR介导的EPO信号传导可能与宫颈病变中的新生血管形成相关。糖尿病视网膜病变时视网膜的新生血管的形成与视网膜的缺血缺氧有密切的关系，糖尿病大鼠视网膜中EPOR的大量表达可能与糖尿病视网膜病变时视网膜新生血管的形成有密切的关系。Kase等[28]研究表明：EPOR在增殖性糖尿病视网膜病变患者的增殖膜的微血管中呈强阳性的表达，玻璃体中的EPO于增殖膜上的EPOR结合，最终导致了新的视网膜新生血管的形成。EPOR在增殖膜无血管间质细胞区的免疫反应可能于视网膜的局部缺血有间接联系。Takagi等[29]研究发现阻断EPO可以抑制玻璃体的新生血管的形成，表明EPO可能参与了视网膜新生血管的形成。但EPO/EPOR系统怎样参与视网膜新生血管的形成机制需进一步研究。
4 EPO治疗糖尿病视网膜病变的研究现状及临床应用前景
EPO在糖尿病视网膜病变治疗中的研究尚处于起步阶段，郭燕等[30]发现腹腔内注射促红细胞生成素对急性高眼压大鼠视网膜有保护作用。还有动物试验显示[31]：外生性EPO在早期糖尿病大鼠的玻璃体内注射可防止视网膜细胞的死亡和保护RBR的功能，这可能是对早期DR治疗的一种新的方法。以上动物试验研究结果均有力地证明了EPO对于糖尿病视网膜病的可能防治作用，但目前EPO的副作用限制了其临床应用。长期大量使用EPO可能产生一些副作用有：血管反应性下降，血压升高，血粘度增加，血栓形成等，情况严重的还会造成脑部供血不足，甚至引发脑缺血。Dillard等还发现给前庭神经鞘瘤病人术前常规应用EPO治疗能使瘤体迅速增长，用免疫组织化学染色的方法确定肿瘤细胞有EPO和EPOR基因的表达。推测EPO可能与该肿瘤的发生有一定关系。长期EPO治疗的患者约30%出现高血压或高血压加重，需要增加降压药的用量来控制血压。而EPO带来的红细胞比积的增加，则成为EPO在糖尿病相关并发症治疗应用中的最大障碍。长期EPO治疗的糖尿病大鼠红细胞比积可以增加45%。EPO提高血红蛋白浓度，增加血液粘滞性，促进血小板聚集，使糖尿病患者更易于形成血栓，增加心血管事件的发生率。
近来发现EPO的神经保护作用及促红细胞生成作用具有不同的作用机制和特点，两种作用所需EPO的刺激时间不同，参与作用的受体也不同。研究表明，促红细胞生成需要持续不断的EPO刺激，而神经保护作用仅需要短暂的EPO刺激[32]。据此，可以通过缩短EPO的作用时间，将这两种作用分离。Erbayraktar等[33]将EPO分子中唾液酸基团全部去除生成asialoEPO，其与EPO受体的亲和力不变，但半衰期较普通EPO明显缩短，试验证明，asialoEPO同样具有完全的神经保护作用[34,35]，而不刺激红细胞的生成。asialoEPO虽然半衰期很短，但其与EPO受体的亲和力与普通EPO无区别，仍然不能完全排除刺激骨髓红祖细胞的可能性。根据以往的研究，骨髓中EPO的受体主要是（EPOR）2，属于I类细胞因子家族，参与EPO促红细胞生成的作用。而介导神经保护作用的受体无论在分子量、受体亲和力或蛋白结构上都不同于（EPOR）2[36]，在对EPO构效关系的研究中发现，EPO分子中与两种受体结合的位点分别位于不同的区域[37]。Leist等[38]将EPO分子中所有赖氨酸通过氨基甲酰化作用转化为瓜氨酸，产生CEPO。体外试验表明CEPO即使在持续高浓度存在的情况下也完全不能与造血细胞上的（EPOR）2结合，且无促红细胞生成的活性，但抑制神经细胞凋亡的活性不变。此外，近来还有研究将EPO与胰岛素样生长因子（IGF1）联合应用[39]，可以产生协同抗凋亡作用，减少给药剂量，减少副作用。另外，在眼局部使用EPO能否降低全身使用EPO所产生的副作用，有待进一步研究证实。
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