2　结果

　　2.1大鼠糖尿病模型

　　实验组腹腔注射STZ后成功复制出糖尿病动物模型：T1组15例，成功14例，失败1例；T3组15例，成功13例，失败2例；T5组15例，成功14例，失败1例. 通过Fisher确切概率计算法（PT1:3，PT3:5，PT1:5的概率分别为0.388，0.388，0.517），可见三组之间的造模成功率无显著差异，故可以认为三组的造模成功率基本一致.

　　2.2各组不同时段视网膜VEGF表达

　　免疫组化染色结果显示，对照组各组视网膜VEGF可见弱表达，一般在内核层可见少数阳性染色，但不随时间变化而改变（图1）. 各组不同时段之间的VEGF A值并无显著性差异（表1）. 实验组在成模后1 mo， VEGF表达较对照组仅略有增强，其A值与对照组相比并无显著性差异，但随着时间的延长，实验组VEGF表达明显增强，特别是T5组，视网膜内核层、节细胞层及血管壁等均可见阳性染色（图2）.表1各组不同时段VEGF及HIF1α A值（略）

　　2.3各组不同时段视网膜HIF1α表达通过免疫印迹检测，对照组各组HIF1α有弱表达，其A值维持一基线状态，不同时段差别无统计学意义（表1）. 实验组各组HIF1α表达均明显增强，与对照组相比有显著性差异，但各组A值并不随时间改变而发生显著变化，组间差别无统计学意义（表1）. 图3显示成模5 mo后实验组与对照组HIF1α免疫印迹结果（M为标记物，上下两个条带分别代表225 bp和162 bp）.

　　3　讨论

　　STZ大鼠是目前比较公认的经典糖尿病DR模型，基本可以模拟人背景型DR的大致病理改变［2］. 本实验成功复制出STZ大鼠模型，成功率在90%左右，保证了后续实验结果的真实可信.
　　
　　糖尿病DR是糖尿病微血管病变在眼底独特环境中的表现，其中VEGF起着举足轻重的作用. VEGF导致新生血管的原因，一方面是直接促进微血管内皮细胞增生，另一方面是VEGF使微血管内皮细胞通透性增强，大分子物质如纤维蛋白原等进入细胞外基质中形成纤维蛋白凝胶，允许并支持新生血管和基底细胞向内生长［3］. 临床研究也发现，在合并活动性新生血管病变的眼如糖尿病性DR、视网膜中央静脉阻塞、早产儿DR等的眼内液中VEGF表达显著增高，而在无新生血管对照眼的眼内液中则表达较低. 眼内直接给予VEGF更能诱发出典型的新生血管病变［4］. 本实验在成模后3 mo和5 mo大鼠视网膜上观察到了明显的VEGF高表达，并且有随时间延长表达逐渐增多的趋势，与对照组相比有显著性差异，而1 mo组则没有明显增多，提示VEGF是在缺氧发生后，某些始动因素的刺激下表达增多，符合糖尿病DR的发展规律.
　　
　　为明确DR时引起VEGF表达增多的原因，本实验还观察了缺氧诱导因子1α（HIF1α）的变化. HIF1是细胞在缺氧条件下产生的核蛋白，它作为转录因子与靶基因结合，促进其转录，从而使机体产生一系列缺氧适应反应. HIF1是一种异源二聚体，由HIF1α和HIF1β两个蛋白质亚基组成， HIF1β亚基主要起结构性的作用，在细胞内稳定表达；HIF1α则是主要的功能亚基，受缺氧信号的调控，并且只有在缺氧状态下才能稳定表达. HIF1的活性主要由HIF1α的蛋白质水平和活性决定［5］. 能被HIF1诱导的基因启动子或增强子内有一个小于100 bp的DNA序列，称为缺氧反应元件（hypoxia response element, HRE），介导细胞对缺氧的反应，HRE由HIF1结合位点和两侧的功能序列构成. 缺氧条件下HIF1α和HIF1β蛋白由胞浆进入核内，发生二聚形成稳定的HIF1，活化的HIF1与靶基因HRE中的HIF1结合位点结合，形成转录起始复合物，促进其转录，引起一系列细胞对缺氧的反应［6］. 而VEGF正属于上述靶基因之列，其转录起始点上游具有HRE结构，缺氧状态下可被HIF1激活而表达增多［7］. 本研究发现，造模成功后1 mo，即可见到HIF1α的表达增多，与对照组有显著性差异，提示此时视网膜已经发生缺氧性改变. 但是其后一段时间内，虽然HIF1α都保持高表达，但是不同时段之间却并无显著性差异，即HIF1α似乎并无随时间延长不断增多的趋势，这可能与HIF1的半衰期短有关. Huang等［8］发现：由于HIF1经泛素蛋白酶途径不断发生水解，使其在常氧下的半衰期小于1 min，因此它很难在细胞内大量聚集，只能在受到缺氧信号刺激后不断产生，如果缺氧状态持续存在，则它的表达就持续增高，不过不能像VEGF那样表现出随时间不断增高的趋势.

　　由于实验中对VEGF的检测采用的是免疫组化的方法，受敏感性的限制，在成模后1 mo时，尚不能发现VEGF蛋白质表达的变化，按照实验中HIF1α的变化规律，推测此时VEGF表达也应有一定程度的增多，这有待今后加以探索.

　　【参考文献】

　　［1］Shen WY, Lai CM, Graham CE,et al. Longterm global retinal microvascular changes in a transgenic vascular endothelial growth factor mouse model［J］. Diabetologia, 2006, 49(7): 1690-1701.

　　［2］宋鄂, 董宇, 石博, 等. STZ糖尿病大鼠视网膜病变模型的评价［J］.眼科研究, 2004, 24(2):124-127.

　　［3］Ferrara N, DavisSmyth T. The biology of vascular endothelial growth factor［J］. Endocr Rev, 1997,18(1):4-25.

　　［4］Suganthalakshmi B, Anand R, Kim R, et al. Association of VEGF and eNOS gene polymorphisms in type 2 diabetic retinopathy［J］. Mol Vis, 2006,11(12):336-341.

　　［5］Arjamaa O, Nikinmaa M. Oxygendependent diseases in the retina: Role of hypoxiainducible factors［J］. Exp Eye Res, 2006,83(3):473-483.

　　［6］Chen C, Pore N. Regulation of glut 1 mRNA by hypoxiainducible factor: Interaction between Hras and hypoxia［J］. J Biol Chem, 2001,276(12):9519-9525.

　　［7］Michel G, Minet E, Mottet D, et al. Sitedirected mutagenesis studies of the hypoxiainducible factor1 alpha DNAbinding domain［J］. Biochim Biophys Acta, 2002,1578(13):73-83.

　　［8］Huang LE, Arany Z, Livingston DM,et al. Activation of hypoxiainducible transcription factor depends primarily upon redoxsensitive stabilization of its alpha subunit［J］. J Biol Chem, 1996, 271(50):32253-32259

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