2结果

　　2.1兔RPE细胞培养与免疫组织化学鉴定原代培养的RPE细胞多呈扁型或多角形，细胞浆内富含棕褐色颗粒，传代后色素颗粒消失，细胞形态转为梭形. 角蛋白阳性细胞细胞浆呈棕黄色着色，阳性率几乎达100%.

　　2.2RPE细胞TERT表达TERT免疫组织化学检测显示阳性表达细胞细胞核呈斑块状或点状染色，其中部分染色较淡呈弱阳性表达（图1）.

　　图1兔RPE细胞TERT的阳性表达SABC ×400（略）

　　2.3ASODN对RPE细胞TERT表达的抑制免疫组织化学检测显示5 μmol/L和10 μmol/L的ASODN对TERT的表达有明显的抑制作用，其表达阳性率分别为(28.7±5.8)%，(26.3±6.2)%，而空白对照组TERT的表达阳性率为(37.6±4.6)%，与该对照组比较P<0.01，差异有统计学意义. SODN各浓度组作用下的阳性表达率与空白对照组相近，其差异无统计学意义(P>0.05, 表1).

　　2.4ASODN对RPE细胞增生活性的抑制作用ASODN 2.5， 5和10 μmol/L浓度组与0 μmol/L浓度组比较，细胞的A值差异有统计学意义. 这提示ASODN对RPE细胞的抑制作用可能具有剂量依赖性. SODN组各浓度与0 μmol/L浓度组比较，差异均无统计学意义(表2).

　　表1ODN作用下RPE细胞的TERT表达（略）

　　表2ODN作用下RPE细胞的增殖（略）

　　3讨论

　　PVR的病理过程实质为RPE在炎性因子等刺激下，移行、增生并有表型转化，分泌胶原，形成增生性的视网膜前膜及下膜. 膜的收缩表现为星形皱褶、弥漫性皱褶、环行或前部收缩，以及“餐巾环”、“晾衣杆”样改变，造成牵拉性视网膜脱离［6-7］. 鉴于RPE细胞的异常增生在PVR病变中起主要作用，抑制RPE细胞中端粒酶的活性成为防治PVR的一个方向. 端粒酶是端粒的核酸聚合酶，主要由端粒酶RNA组分(TR),端粒酶逆转录酶（TERT）和端粒酶相关蛋白（TEP1）3个亚单位组成. 其中TERT是端粒酶的催化亚基，是决定端粒酶活性的限速因子. TERT可在端粒酶活性阴性的细胞异位表达，从而使端粒酶活性重现，使细胞寿命延长. 本实验证实，RPE细胞可表达TERT，其阳性表达率与细胞的增生活性呈正相关，提示TERT可能是PVR的发病机制之一. 与Oh等在心肌细胞、Minamino等在大鼠肺血管平滑肌细胞的研究中发现端粒酶活性显著增高相附，均提示TERT与细胞增殖密切相关［8-9］.

　　反义核苷酸技术是指按照碱基互补配对原则，选择与特定互补链(靶基因)特异性结合，干扰基因的复制、转录、剪切或翻译，从而阻碍某种蛋白合成的一类核酸研究新技术. 目前，作为基因治疗的一种方法，正在将反义核苷酸作为一种潜在的药物进行疾病的治疗. 在细胞和组织内有各种核酸酶，能降解寡核苷酸，采取合适的修饰方法可以避免寡核苷酸的降解. 我们采用硫代修饰的ASODN(SASODN)，即核苷酸片段骨架磷上的羟基被巯基取代. SASODN具有良好的溶解性、杂交性和稳定性，并能诱导激活大量核糖核酸酶H而被广泛应用，促进对RNA的降解；无论在细胞内外，SASODN均具有很强的抗核酸酶活性［10］. 本研究显示ASODN可显著抑制TERT在RPE细胞中的表达，而SODN则对TERT表达没有明显作用. 我们采用MTT比色法检测了ODN对细胞增生的影响，统计学分析显示ASODN对RPE细胞的体外增生有不同程度的抑制，并呈浓度依赖性，而SODN则无显著性影响，从而显示出ASODN序列特异性抑制基因表达及细胞增生的作用. 同时，在不同浓度ASODN的作用下，TERT的阳性表达率与RPE细胞的生长抑制有明显相关，提示TERT可能是RPE细胞增生的机制之一. ASODN对TERT的抑制作用为临床上治疗PVR提供了新思路，但其具体机制尚需进一步探讨.

　　【参考文献】

　　［1］ Dickson MA, Hahn WC, Ino Y. Human keratinocytes that express HTRET and also bypass a P16（INK4a）enforced mechanism that limits life span become immortal yet retain normal growth and differetiantion characteristics［J］. Mol Cell Biol,2000,20(1):1436-1447.

　　［2］ Engelhardt M, Martens UM. The implication of telomerase activity and telomere stability for replicative aging and cellular immortality［J］. Oncol Rep,1998,5(1):1043-1052.

　　［3］ Reches A, Peddie C, Rendell S. Neoplastic transformation and cytogenetic changes after Gamma irradiation of human epithelial cells expressing telomerase［J］. Radiat Res,2001,155:222-228.

　　［4］ Cao Y, Li H, Mu FT, et al. Telomerase activation causes vascular smooth muscle cell proliferation in genetic hypertension［J］. FASEB J, 2002,16(1):96-98.

　　［5］ Kolquist KA, Ellisen LW, Counter CM, et al. Expression of TERT in early premalignant lesions and subset of cells in normal tissues［J］.  Nat Genet, 1998,19(2):182-188.

　　［6］ Jerdan JA, Pepose JS, Michels RG, et al. Proliferative vitreoretinopathy membranes: an immunohistochemical study［J］. Ophthalmology,1989,96(6):801-810.

　　［7］ Wu WC, Kao YH, Tseng HY. The cell cycle distribution of cultured human retinal pigmented epithelial cells under exposure of antiproliferative drugs［J］. J Ocul Pharmacol Ther, 2003,19(1):83-90.

　　［8］ Oh H, Taffet GE, Youker KA, et al. Telomerase reverse transcriptase promotes cardiac muscle cell proliferation, hypertrophy, and survival［J］. Proc Natl Acad Sci U S A, 2001,98(18): 10308-10313.

　　［9］ Minamino T, Mitsialis SA, Kourembanas S. Hypoxia extends the life span of vascular smooth muscle cells through telomerase activation［J］. Mol Cell Biol, 2001, 21(10):3336-3342.

　　［10］ Jiang YA, Luo HS, Zhang YY, et al. Telomerase activity and cell apoptosis in colon cancer cell by human telomerase reverse transcriptase gene antisense oligodeoxynucleotide［J］. World J Gastroenterol, 2003,9(9):1981-1984.

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