【摘要】 　　目的：通过研究高温氧化作用对人晶体上皮细胞内热休克蛋白质(HSP)的效应来探讨白内障的发病机制。方法:细胞分别在高温(45℃)、氧化(50mmol/LH2O2)条件下，培养30min后恢复至正常条件下，在生物介质中恢复于不同时间段(0h，2h，4h，6h，16h，24h)，采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测HSP70的水平。结果:生理状态下和应激状态下均有热休克蛋白质的表达。热应激和氧化应激后2h导致HSPmRNA的水平增加。但是每组HSP70的表达到达峰值的时间间隔2～6h。以后逐渐降低，但是他们在16h仍维持较高水平。结论：HSPs在晶状体上皮细胞里存在，并且在应激之后可被诱导产生。 数据表明它可能在应激状态下对晶状体上皮细胞起重要保护作用。

　　【关键词】 应激 热休克蛋白(HSP) 人晶状体上皮细胞(HLB)

　　最佳的视敏度主要依赖于晶状体的的透明度。晶状体透明度的维持是由其组成蛋白质的构象决定的，天然蛋白的稳定性决定了蛋白构象的稳定，蛋白质四级结构的维持依赖于新合成多肽的合理折叠和细胞对环境或病理生理应激产生的足够的保护作用[1]。蛋白质天然结构的不稳定导致晶状体的混浊，因而详细了解晶状体蛋白如何长期维持它们的天然结构是非常必要的。进一步而言晶状体独特的解剖的位置使其长期暴露于一种应激的环境中。由于晶状体没有直接的血供，因此一些必不可少的生物大分子如氧或氨基酸供应是有限的，而代谢废物如毒素炎性物质在附近长期保留。所以，晶状体需要特殊的保护作用以抵抗微环境诱导的应激。如果没有这样的保护作用，晶状体蛋白质将降解而导致白内障，大多数动植物细胞应激反应时过量表达热休克蛋白[2]。因而，本研究检测了外源性应激条件下，晶状体中热休克蛋白mRNA(HSPmRNA)表达水平的变化。 实验表明应激环境诱导人晶状体上皮细胞中HSP70mRNA的过度表达，这可能对晶状体起着重要保护作用。

　　1 材料和方法

　　HLB-C3细胞系 (由中国医科大学附属第一医院的眼科学系提供) 含15%的小牛血清在DMEM37 ℃培养箱里培育，HLB-C3细胞系的高温应激和氧化应激分别通过如下方式诱导：(a)45℃暴露30min,(b) DMEM中含50mmol/LH2O2培育30min。将一些应激细胞暴露于37℃普通培养介质中使其复原，分别暴露0h，2h，4h，6h，16h 和24h。总的mRNA暴露于应激条件之后立即从类似的细胞群中分离出来用于RT-PCR。

　　2 RT-PCR

　　总RNA可由胍基酚三氯甲烷提取方法从新鲜制备的人晶状体上皮细胞中分离， 在1%的琼脂凝胶中电泳确定总RNA样品在结构上的完整性之后，1μg的RNA通过oligo(dT)被反向转录为初始链，这要取决于是否存在对逆转录的加工指导。然后在总体积50μL的环境中，在初始模板的指导下以cDNA作为模板完成PCR。HSP70(461bp)的模板序列是F 5’-TGC CCG CCT ACT TCA ACG A-3’，R 5’-CCG CGT GAT GGA CGT GTA G-3’;β-actin(690bp)的模板序列是F 5’-GAT TGC CTC AGG ACA TTT CTG-3’，R 5’-GAT TGC TCA GGA CAT TTC TG-3’)。10倍反式缓冲器和Taq聚合酶取自Eppendorf。使用热启动的PCR cDNA在94℃ 10min融化，使DNA变性，然后分别在94℃，58℃以及72℃热电流中各30秒完成36循环。在终止周期之后，延长聚合反应10min以完成全部反应。PCR作用于每个未被反向转录为cDNA的RNA的样品，作为一种消极控制同时没有发现放大产物。2%的琼脂凝胶中电泳分离PCR放大产物并在图象工作站用溴化二氨乙苯啡啶染色以备观察。

　　3 结果

　　生理和应激状态下均存在热休克蛋白(HSPs)，热应激和氧化应激后2h导致HSPmRNA的水平增加。但是每组HSP70的表达到达峰值的时间间隔2～6h。以后逐渐降低，但是他们全部在16h仍维持较高水平。

　　将对照组、高温组、氧化组晶状体上皮细胞中HSP70mRNA的表达进行定量分析，运用SPSS11.0统计软件进行数据处理，结果显示：对照组、高温组、氧化组晶状体上皮细胞中HSP70mRNA的相对表达值(HSP70/Actin的灰度比值)经统计学分析有以下结果，见表1。表1 各组HSP70mRNA不同时间点灰度值的比较(略)注：*P<0.05 vs对照组，#P<0.05 vs对照组。

　　4 讨论

　　白内障的发病机理至今并不完全清楚，除手术治疗外缺乏有效的防治方法。证据表明，白内障发病与晶状体上皮细胞调亡有关[3]。体外实验证实，多种诱导细胞调亡的应激因素，如过氧化氢，紫外线等均可导致白内障的发生。许多能使细胞调亡的应激性刺激，如热休克或者氧化应激，可诱导合成不同的热休克蛋白抵抗细胞受到的应激。大多数热休克蛋白对细胞起着重要的保护作用并作为“分子伴娘”保护其他蛋白质，但还没有充分的证据表明环境应激能否诱导热休克蛋白在人晶状体上皮细胞里合成增加。而这种合成增加是否在转录水平进行调控还不很清楚，HSP70的合成迅速增加是细胞对环境刺激的一个普遍反应[4]。本实验以体外培养的人晶状体上皮细胞作为对象观察热休克蛋白是否作为一个应激诱导的蛋白质或作为细胞应激的一个标志。我们选择高温，这个经典的诱导热休克蛋白合成的刺激方法。然后，我们选择氧化应激，一个导致白内障发病的刺激因素，观察是否会导致热休克蛋白(HSPs)的表达增加。结果显示，暴露于高温应激和氧化应激这两种应激情况下HLB细胞中存在这种应激反应。外源性应激诱导的热休克蛋白的表达，提示在热休克蛋白参与了人晶状体上皮细胞抵抗应激引起的损伤。我们相信诱导热休克蛋白的过量表达能延缓白内障的发展并且给临床的治疗提供新思路。

　　【参考文献】

　　[1]Bukau B,Dewerling E,Pfung C,et al.Getting newly synthesized proteins in shape[J].Cell,2000，101:119122

　　[2]Leppa S,Kajanne R,Arminen L,et al.Differentiation induction of HSP70 encoding genes in human hematopoietic cells[J].J Biochem,2001，276:3171331719

　　[3]Li WC,Kuszak JR,Dunn K,et al.Lens epithelial cell apoptosis appears to be a common cellular basis for non-congenital cataract development in humans and animals[J].J Cell Biol,1995,130:169181

　　[4]Bagchi M,Katar M,Maisel H,et al.Effect of exogenous stress on the tissue-cultured mouse lens epithelial cells[J].J Cell Biochem,2002,86(2):302306