【摘要】 目的 检测与单核/巨噬细胞株THP-1细胞共培养的人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞c-fos的表达。方法 在Transwell小室中共培养THP-1细胞和人RPE细胞达不同的时间(0，2 h，3 h，24 h，48 h，72 h)，采用免疫荧光染色法和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)观察RPE细胞c-fos蛋白和mRNA的表达变化。结果 在未与THP-1细胞共培养的RPE细胞中，c-fos表达微弱或不表达，细胞浆和部分细胞核为浅黄绿色荧光。与THP-1细胞共培养达2 h时，RPE细胞的荧光强度逐渐增强并出现核移位。随着与THP-1细胞共培养时间的延长，RPE细胞c-fos mRNA的表达(0 h，0.40±0.07)开始逐渐增强，于2 h时达峰值(2 h， 0.91±0.10，P=0.002)，随后表达减弱，至3 h时(3 h，0.51±0.08)降至近未共培养时的水平。结论 与THP-1细胞共培养可在短期内迅速上调体外培养的人RPE细胞c-fos蛋白和mRNA的表达，且蛋白表达出现核移位现象，提示THP-1细胞可引起RPE细胞c-fos的活化。

　　【关键词】 视网膜色素上皮;THP-1细胞;c-fos

　　Up-regulation of c-fos in cultured human retinal pigment epithelial cells by co-culturing with THP-1 cells

　　WANG Jingbo*， HUI Yannian， GUAN Juan*， et al.

　　* Department of Ophthalmology， the Second Affiliated Hospital， General Hospital of Chinese People’s Liberation Army， Beijing China， 100091

　　[Abstract] Objective To study the effects of co-culturing with THP-1 on the expression of c-fos in human retinal pigment epithelium (RPE) cells in vitro. Methods RPE cells were co-cultured with THP-1 cells in transwell inserts for 0， 2， 3， 24， 48 and 72 h. Immunofluorescence staining and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) were used to detect the levels of c-fos protein and mRNA in RPE cells. Results RPE cells that were not co-cultured with THP-1 cells revealed either faint or no green fluorescence of c-fos in the cytoplasm and some nuclei. When co-cultured with THP-1 cells for 2 h， green fluorescence labeling of c-fos showed an obvious increase with stronger green fluorescence translocated to the nuclei. After co-culturing with THP-1 cells， c-fos mRNA (0 h， 0.40±0.07) increased rapidly in RPE cells and the enhancement peaked at 2 h (2 h， 0.91±0.10， P=0.002)， and declined to a similar level as the cells that were not co-cultured after 3 h (3 h， 0.51±0.08). Conclusion Co-culturing with THP-1 cells can quickly up-regulate c-fos protein and mRNA in cultured human RPE cells within a short time period， and induces its nuclear transposition， which suggests the THP-1 cells can activate c-fos.

　　[Key words] retinal pigment epithelium; THP-1 cell; c-fos

　　视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium， RPE)细胞是参与葡萄膜炎、增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)等[1]多种眼病的重要细胞[1-3]。其中单核/巨噬细胞的浸润参与了这些眼病的发生和发展，并对RPE细胞的早期基因改变及其后的生物学性状变化起关键作用。c-fos为一重要的核转录因子，属于即刻早期反应基因家族[4]，是与多数细胞增殖有关的原癌基因。本实验中，我们欲研究与单核/巨噬细胞株(THP-1细胞)共培养的体外培养的人RPE细胞的c-fos表达，从而明确c-fos在RPE细胞早期生物学性状改变中的作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 Dulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco’s modified Eagle medium， DMEM)购自美国Hyclone公司，新生小牛血清购自杭州四季青公司，Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，反转录试剂盒购自美国Promega公司，Taq酶购自美国MBI公司，兔抗人c-fos多克隆抗体购自武汉博士德公司，异硫氰酸荧光素(FITC)标记羊抗兔IgG购自北京中杉公司，其他试剂均为国产或进口分析纯。c-fos引物由上海生工合成。3个不同个体成年健康男性角膜移植后的眼球用于行原代RPE细胞培养，取第4～第8代细胞用于实验。THP-1细胞购自美国标准生物品收藏中心。

　　1.2 方法 c-fos引物，上游5′ TGCTGAAGGAGAAGGAAAAA 3′，下游5′ TGCATAGAAGGACCCAGATA 3′ [344碱基对(bp)];甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)引物，上游5′ GAAGTGAAGGTCGGAGTCA 3′，下游5′ TTCACACCCATGACGAACAT 3′(402 bp)。

　　RPE细胞消化后，接种于6孔培养板中，置于5% CO2孵箱中培养。当细胞融合>75%时，将Transwell小室置于培养孔上，并将THP-1细胞接种于小室上方，分别共培养达0、2 h、3 h、24 h、48 h和72 h。细胞共培养结束后，拿去Transwell小室，弃去培养液，换以37℃预热的磷酸盐缓冲液(PBS)并轻柔晃动培养板2次，然后收集细胞，以备行RNA提取。同时设对照组，即为RPE细胞更换37℃预热的、含10%新生牛血清的新鲜DMEM，培养时间分别达0、2 h、3 h、24 h、48 h和72 h。

　　RPE细胞在共培养结束后，以台盼蓝染色计数法检测各处理组的活细胞数目。具体步骤如下：收集各孔细胞，制备成单细胞悬液，并与等体积的0.3%的台盼蓝溶液混合，在光学显微镜下计数并计算细胞存活率。

　　细胞爬片用95%乙醇固定20 min，PBS漂洗;用3%过氧化氢灭活15 min，PBS漂洗;用羊血清室温封闭20 min;加入0.5% 曲拉通X-100，室温置10 min;置兔抗人c-fos多克隆抗体(1∶100)，湿盒4℃过夜，PBS漂洗;用FITC标记羊抗兔IgG(1∶100)，湿盒37℃孵育60 min，PBS漂洗;用甘油缓冲液封片，激光共聚焦显微镜观察并在同一电压条件下照相。同时设PBS替代第一抗体的空白对照。

　　收集的细胞用Trizol提取总RNA，反转录合成cDNA第1链，产物进行PCR。退火温度分别为：c-fos，54℃，1 min;GAPDH，55℃，1 min。GAPDH反应为30个循环，c-fos为35个循环。PCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察照相。采用Kodak Digital Science 1D分析软件分别读取各片段灰度值，以c-fos的灰度值与GAPDH灰度值的比值代表c-fos mRNA的水平。

　　1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0统计分析软件，对刺激因素作用后不同时间点间的比较进行单因素方差分析。绘图采用Origin 7.0软件。

　　2 结果

　　2.1 细胞活力检测结果 台盼蓝染色实验测得，RPE细胞与THP-1细胞共培养后，细胞的存活率在96%以上。

　　2.2 免疫荧光染色结果 在尚未与THP-1细胞共培养的RPE细胞中，c-fos表达微弱或不表达，细胞浆和部分细胞核为浅黄绿色荧光(见图 1)。随着与THP-1细胞的共培养时间的延长，RPE细胞c-fos的表达逐渐增强，荧光强度增高，呈绿色或深绿色。THP-1细胞共培养达2 h时，与未行共培养的RPE细胞比较，c-fos的表达明显增强，并出现核移位，细胞核呈强绿色荧光(见图 2)。在与THP-1细胞共培养后，RPE细胞c-fos蛋白表达的荧光强度于2 h时达峰值，随后荧光强度开始减弱，并逐渐降至未行共培养时的荧光强度水平。对照组各时间点RPE细胞c-fos的表达无明显改变。

　　2.3 THP-1细胞共培养上调RPE细胞c-fos mRNA的表达 与尚未共培养的RPE细胞相比，与THP-1细胞共培养达2 h时，RPE细胞c-fos mRNA的表达即显著增强(F=52.37，P=0.002)，随后表达开始减弱，于3 h时降至与未共培养时的相近水平，随后基本维持在该水平(见表1、图3)。对照组内各时间点c-fos mRNA的表达变化无统计学意义(F=0.75，P=0.64)。

　　3 讨论

　　在许多眼病中，RPE细胞暴露于细胞因子(白介素、肿瘤坏死因子等)、淋巴细胞和巨噬细胞等共同形成的环境中，如增生性玻璃体视网膜病变、年龄相关性黄斑变性和葡萄膜炎等[1-3，5-7]。这些微环境的改变对于RPE细胞的早期基因改变及其后的生物学性状的变化起着关键作用，但目前对于RPE细胞的早期基因改变尚未完全阐明，如能了解这些刺激因素对于RPE细胞的早期作用，则有助于进一步阐明这些眼病的机制并制定防治策略。

　　原癌基因是一类编码关键性调控蛋白的正常细胞基因，参与调节正常细胞的生长、发育、分化和增殖过程。一般情况下在正常细胞中表达水平很低，当其受到某些因素的作用而活化或过度表达时，细胞过度增殖，可导致一些增生性疾病甚至肿瘤。其中有些原癌基因受到细胞外生长或分化因子刺激时能快速被诱导转录，其表达产物为核内转录因子，能进一步调控其他基因的转录和表达，常称之为“即刻早期基因”，主要有fos、jun、myc、myb、ets、ski等。

　　c-fos是一重要的早期转录因子。细胞中的即刻早期基因能介导细胞的生长与分化，当细胞受到生长因子、离子射线、细胞因子等刺激引起细胞膜去极化时，本来处于休眠状态的即刻早期基因很快被激活，导致细胞的增殖，对细胞生长分化和损伤修复起重要作用。c-fos可在增殖和非增殖细胞中由许多环境刺激物诱发即刻、短暂的表达，成为信息传递的第三信使，因此认为c-fos表达是细胞增殖的信号[4]。在培养的细胞中，c-fos高表达可使细胞周期从G1期进入S期。

　　我们发现，在与THP-1细胞共培养后，RPE细胞c-fos mRNA和蛋白的表达均在短时间内快速增强至峰值，且出现核转位现象。这提示THP-1细胞共培养可激活RPE细胞的c-fos，从而启动该基因的一系列作用。与其他研究结果一致，我们的研究表明，在受到细胞外的刺激后，c-fos基因很快被激活，并随后降至正常水平[2]。c-fos基因表达由峰值降至正常水平，并不意味着c-fos已不发挥作用。作为信号转导的第三信使，c-fos能进一步调控其他基因的转录和表达，从而调节细胞的增生和分化等。THP-1细胞为单核/巨噬细胞系，可以产生多种细胞因子，如血管内皮生长因子、肿瘤坏死因子和白介素-8等[6]。与周围血中单核细胞培养相比，THP-1细胞培养、传代更容易，使实验更易于进行[6]。

　　巨噬细胞可刺激RPE细胞的增生和移行[7]。结合我们的实验，我们分析，巨噬细胞对RPE细胞增生和移行的调控可能归因于c-fos基因的早期快速活化，但c-fos在RPE细胞中的具体作用、其调控的基因及信号转导路径等都需要进一步深入的研究。