二、无血清单细胞克隆培养角膜缘干细胞及评价方法

　　对于角膜缘干细胞增殖分化调控机制的研究，多采用离体培养方法进行。角膜缘干细胞离体后培养，虽然在一定程度上改变其固有的生物学特性，但仍有一种有效的研究方法。以往的细胞培养均加入血清等天然培养成分[11，14]，血清的生物效应早已证明，它含有多种促细胞生长因子、促粘附因子及其它活性物质等。添加血清虽有利于细胞生长，但不明成分也增多了，对分析实验结果增加了困难，尤其在对增殖分化调控的研究中，无法分析实验结果。针对这一问题，Kruse等[5]最早提出角膜缘干细胞无血清单细胞克隆培养方法，并利用此方法，对角膜缘干细胞的增殖分化调控机制做了系统化的研究。这种无血清单细胞克隆培养基是在MCDB151基础培养基中加入胰岛素、转铁蛋白、氢化考的松、硒、钙、磷酸乙醇胺等。这种培养条件适合TAC细胞增殖，而干细胞在此培养条件下保持静态。可见，此培养方法可用来研究调节干细胞转化为TAC细胞的因子。

　　对于此种培养有其独特的增殖、分化评价方法[12]。细胞增殖评价指标包括克隆形成系数（CFE）、克隆大小及溴脱氧尿苷（BrdU）标记法。CFE为评价能形成克隆的种植细胞的比例。克隆大小即每克隆的细胞数，克隆根据其大小分为以下三类：小克隆为细胞数小于10个，中克隆为细胞数介于11-20个，大克隆为细胞数大于20个。BrdU标记法可评价细胞增殖率及每个克隆增殖细胞的分布。BrdU标记指数为BrdU阳性细胞与每克隆细胞总数的比例。

　　细胞分化评价包括克隆形态的观察；细胞角蛋白单克隆抗体检测，如用AE-5检测角膜上皮表达的K3角蛋白[16]；是否形成角质化套等。

　　三、角膜缘干细胞和分化调节机制

　　通过各种方法分离纯化角膜缘干细胞、采用无血清单细胞克隆培养方法，根据其特有的增殖分化评价标准对角膜缘干细胞增殖分化调节机制研究已取得较大进展。现将目前研究新进展总结如下：

　　（一）血清对角膜缘干细胞增殖分化调节

　　角膜缘上皮与血管化组织接近，其增殖分化受血清来源的因子的调控[17]。利用无血清克隆培养基分别对周围角膜和角膜缘组织进行培养，其中加入1％小牛血清，周边角膜CFE（克隆形成系数）和克隆大小减少，而对角膜缘培养无影响，两种培养克隆形态、BrdU标记及AE-5染色均无差异。在培养基中加入10％或20％小牛血清后，CFE和克隆大小在角膜缘培养中增加，而周边角膜培养呈剂量依赖性减少。值得注意的是角膜缘培养出现大量独特类型克隆，表现为BrdU标记强，异质性且AE-5阴性，表明处于增殖未分化状态，这些克隆在以后培养中表现边连续生长。说明血清中含有因子，可刺激角膜缘的原始细胞即干细胞克隆增殖[8]。且只有达一定浓度时，血清中的因子才能发挥刺激作用。

　　（二）视黄酸对角膜缘干细胞增殖分化调节

　　血清中含丰富的生长调控剂，包括促分裂原和生长抑制剂。视黄酸在血清中浓度10-8M，视黄醇即维生素A，浓度为1～3×10-6M。两者均为一皮细胞增殖分化的调节因子。研究表明，视黄酸对于未分化干细胞的分化具有选择作用。

　　在周边角膜上皮的克隆培养中，视黄酸剂量依赖性地减少克隆大小及BrdU标记指数，即抑制克隆增殖。因为周边角膜上皮仅含TAC细胞，所以此发现最初分离的TAC细胞增殖可被视黄酸剂量依赖性地抑制。

　　与周边角膜一样，角膜缘早期培养的克隆大小和BrdU标记指数被浓度10-8M的视黄酸抑制。但与周边角膜培养不同，浓度为10-8M的视黄酸选择性地允许角膜缘克隆在晚期连续增殖。角膜上皮对视黄酸的反应性与周边角膜上皮的不同说明角膜缘上皮含不同于TAC细胞的独特原始细胞，即干细胞。

　　连续的角膜缘和周边角膜上皮的克隆增殖，可导致角质化套的表达。因为正常兔角膜上皮不表达角质化套，因此角质化套表达为异常分化。加入浓度为10-8M或10-7M的视黄酸后可抑制角质化套的形成。说明视黄酸刺激正常终末分化，抑制异常分化。

　　视黄酸抑制细胞增殖，刺激分化的机制并不完全清楚。加入视黄酸后可诱导转化生长因子-β（TGF-β）以自分泌和旁分泌的方式产生。TGF-β可抑制角膜缘和角膜培养中的克隆增殖，刺激分化。因此，视黄酸的作用可能通过TGF-β实现。

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