外显子片段的7对引物

外显子  正向引物             反向引物
Ⅰ  AATCTTGCTGGCAGCGTG  AGCTGGATTCATTGGGAC
　 TGCAATGAGGTTCTTCTG  TCCAACTCTCTGGTTTGGG
　 CAGTCATCCATAACTTAC  ATATCACCTGCTGAACTC
Ⅱ  CATAGTCAATCCTTGGGC  GGGAACAGAGAGAGAGAG
Ⅲ  GGATTAAGTGGTGCTTCG  AATACGGGAACTGTCCGTGG
　 AGAAGGAAATCCCTGGAG  CATAAGTGACCATGTTCAAG
　 ATTGACTACAACCCCCTG  GCTTGTGGTAACCATGTAAC

　　在50 μl反应体系中含有100ng模板，5μl的10倍缓冲液,5μl的三磷酸脱氧核糖核苷,引物各5 pmol, 0.5 μl 的Vent聚合酶。反应条件：变性94°，30 s，退火55°，30 s，延伸72°，30 s，共35个循环。最后 72°，2 min时，以电泳检测产物。

　　3.突变筛选：用单链构像多态（single-stranded conformation polymorphism,SSCP）法，将以上产物用垂直胶电泳。凝胶主要成分：聚丙烯酰胺为49∶1，浓度为6％；10％过硫酸铵，TBE缓冲液；上样缓冲液为0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯氰、95%甲酰胺。在功率35W电泳10 h，银染观察结果。

　　4.克隆及测序：参照分子克隆实验指南中的克隆方法， 将SSCP法筛选出有带型异常的2例PCR 产物，应用T4克隆试剂盒(美国Clontech公司产品)克隆至PT-Adv载体，选择数个克隆，由内切酶EcorⅠ进行酶切鉴定，重组质粒由ABI-373 全自动测序仪进行双向测序，发现突变则用挑选的其他克隆重新测序以鉴定。

结果

　　一、PCR扩增产物

　　所有PCR扩增产物均为特异性的DNA条带，在SSCP法电泳筛选中，POAG组除第3外显子的第2对引物所扩增产物有2例出现带型异常外（图1），余均未见异常；正常对照组均未发现异常带型。

　　(箭头示筛选出的异常带型)

　　二、克隆的重组质粒

3 900 bp为载体

　　422 bp为酶切片段

　　(每例各选2个克隆)

　　2例克隆的重组质粒，经Ecor Ⅰ酶切鉴定，可见切出422 bp的片段，重组质粒测序结果可见其中1例在相当388氨基酸位置密码子由 GAT突变为AAT，氨基酸由天冬氨酸变为天冬酰胺，即Asp388Asn（图2，3），而另1例序列未测出突变。

“-”示第388密码子，由GAT突变为AAT，

　　即由天冬氨酸替换为天冬酰胺

　　三、突变患者临床资料

　　患者男，27岁，偶然发现左眼视物不清1个月，于1998年3月25日来我院就诊。体检未见异常。眼部检查：右眼视力1.2；左眼光感，光定位不准确。眼压：右眼42 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），左眼52 mm Hg。双眼房角宽，全部开放，无发育异常迹象；前房深度3.0 mm。右眼底视乳头苍白，C/D为0.7，颞上方切迹明显，血管纡曲爬行；左眼视乳头弥漫萎缩、苍白，视乳头苍白＞0.95。光学相干断层扫描：双眼视网膜神经纤维层明显变薄。视野检查：右眼上方偏盲，左眼不能查。术前局部滴用1%毛果芸香碱及0.5%噻吗心安眼液，全身口服醋氮酰胺。用药后右眼眼压22 mm Hg，左眼32 mm Hg,右眼行复合式小梁切除术，术后眼压控制良好。

讨论

　　一、POAG的临床表现

　　POAG是一种常见的青光眼类型，主要表现为高眼压、视神经损害、视野缺损。国外一般分为青少年发病和成年发病两种类型。除发病年龄有区别外，其临床表现基本一致，且由于某些患者的发病年龄出现重叠，国内无标准将其严格区分。一般认为，POAG的发生与遗传因素有关。随着分子遗传学技术的成熟和发展，POAG发病机制的研究已进入分子水平，并有一定进展。

　　二、POAG的基因定位

　　1993年，Sheffield等［1］对一青少年发病的POAG家系成员的 DNA 进行全基因组搜索， 成功地运用小串联重复片段进行连锁分析，最终相关疾病基因定位于第1号染色体D1S194与D1S218之间的区域内，且显示出该疾病基因与D1S210 紧密连锁。另一庞大的POAG家系研究，又将该疾病基因更精确定位。第1号染色体上的青光眼相关疾病基因遂被命名为 GLCIA基因［1］，至今被誉为是青光眼遗传学研究历史的里程碑。随后， 这一发现又在其他10余个家系的连锁研究中多次得到证实［4,5］。

　　三、TIGR基因的结构

　　根据酵母人工染色体序列标志目录图 (yeast artificial chromosome sequence laggedsite conlent mapping）和放射杂交图（radiation hybrid mapping ），最后确定青少年型青光眼致病的相关基因可能是TIGR［6］（基因库检索号R95491，R95443，R47209和U85257）。研究表明，TIGR基因编码是1个504氨基酸的长多肽。基因由被2个大的内含子隔开的3个外显子组成(604、126、782bp)，启动子部位有糖皮质激素元件。

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