3  讨论

    DC是一类具有最强抗原提呈功能的异质性细胞群体，是激发机体免疫反应的最原始的细胞，近年来的研究不断证实，DC是移植排斥反应的重要参与者。从理论上讲，减少或去除DC可减弱抗原的递呈过程和植片的免疫原性，从源头上抑制排斥反应。曾有学者用抗DC单克隆抗体来进行抑制皮肤、脾脏及心脏等移植排斥反应的实验研究[2-4]，取得了成功。以往有学者在角膜移植术前通过紫外线照射    （75 mJ/cm2）和高压氧等方法减少或去除供体内DC可增加植片的存活率[5-6]，但这些方法均有一些缺陷。本研究用抗DC单克隆抗体抑制DC，观察了其对大鼠角膜移植排斥反应的影响，发现可显著抑制排斥反应，延长植片的存活时间。

    本实验设置阳性对照组A0，使用非特异性小鼠抗大鼠抗体，结果与对照组A相比无差异性，可排除单抗蛋白本身引起的排斥反应干扰。实验中发现结膜下给药组停药后，排斥反应发展较腹腔给药组迅速，分析其可能原因是：①因大鼠结膜下空间小，结膜下给药量有限。②结膜下给药仅作用于局部，不能抑制全身的DC，一旦停药，很快有DC进入角膜植片摄取抗原。而腹腔给药可抑制全身DC，停药后，DC再生需要一定时间。

    本实验采用了20%酒精来制作上皮瓣，实验结果显示，与常规角膜移植组相比，保留自体上皮瓣组虽然出现排斥反应的时间稍长，但无统计学意义。这可能是因为抗体本身已将DC的作用抑制，因此植片内抗原性的多少已不重要。

    本实验HE染色结果显示：早期有少量中性粒细胞是术后非特异性炎症反应，术后角膜上皮缺失，只有D组（即保留自体角膜上皮组）角膜上皮有2~3层细胞，上皮缺失的原因可能是术后上皮缺乏神经营养，再加上手术创伤、大鼠眼球较外突、眨眼次数少，均可致上皮脱失。另外排斥反应也可导致上皮的脱落。D组上皮尚有2～3层细胞，可能与保留的是自体上皮有关。术后还可见角膜基质细胞消失，可能是手术创伤导致细胞凋亡所致，正如研究发现，外伤、准分子激光术后，损伤周围角膜基质细胞凋亡。病理切片还发现，A组第14天时水肿、炎症浸润最重，第21天时水肿减轻，大量纤维细胞和植片逐步瘢痕化，与裂隙灯观察结果一致。治疗组排斥反应相对较轻，出现时间较晚，水肿、新生血管、细胞浸润均较轻。HE染色还可见缝线周围细胞浸润明显，围绕缝线呈环行排列，缝线对排斥反应有促进作用。

    IFN-γ主要由活化的Ｔ细胞(包括Th0、Th1细胞和几乎所有的CD8+ Ｔ细胞)和NK细胞产生。IFN-γ在排斥反应中的作用是多方面的，可激活中性粒细胞功能和ＮＫ、巨噬细胞杀伤活性，使之在细胞因子的介导下，产生排斥反应，它不仅可以增加移植物MHCⅠ类和Ⅱ类抗原的表达，而且可以使正常情况下不表达MHCⅡ类抗原的细胞表达MHCⅡ类抗原，增加了移植物的识别和破坏。另外，IFN-γ还可以使巨噬细胞活化，促进Ｔ细胞增殖，诱导促炎细胞因子的分泌[7]。

    很多研究显示IFN-γ可作为急性排斥反应的指标[8-10]。本研究用RT-PCR的方法检测了角膜移植术后第7天时，未经治疗和抗DC单抗治疗后角膜植片IFN-γ的表达情况，发现未经治疗的角膜植片高表达IFN-γ，而在给予抗DC单抗进行免疫抑制治疗的植片IFN-γ表达很少，甚至检测不到。检测不到的原因可能是：①植片未表达IFN-γ。②表达的量较少，再加上RT-PCR方法取的样本量也较少，故检测不出。本研究结果从mRNA水平说明了抗DC单抗可有效降低免疫排斥反应的发生，延长植片存活时间。

    IL-2主要由CD4+和CD8+ Ｔ细胞产生，此外NK细胞和淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)亦可产生，是机体重要的免疫调节因子，具有广泛的免疫调控和免疫增强作用，并参与抗肿瘤效应和移植排斥反应，在急性排斥反应中表达显著。Daane等[11]发现在人心脏移植心肌活检标本培养的Ｂ细胞抗原刺激的心肌浸润细胞可产生较高水平的IL-2。vanEmmerik等[12]的研究结果表明，人心脏移植心肌活检标本的心肌细胞培养所产生的IL-2与移植排斥成正相关。

    本研究发现，虽然移植的角膜组织与其他移植器官相比非常小，但仍可引起血清中IL-2浓度水平的显著升高。A组角膜移植术后第3天血清IL-2的浓度即有所升高，但与正常值相比差异无显著性，第7天时升高显著，第14天达最大峰值，第21天回降。与A组裂隙灯观察结果相一致。经抗DC单抗治疗后，血清IL-2的水平与对照组相比明显较低，说明抗DC单抗能减少角膜移植术后血清IL-2的水平，从而降低排斥的严重程度，延长排斥反应发生的时间。同样，我们发现结膜下注射组C组第14及第21天时血清IL-2的含量要高于腹腔注射组B、D组，与裂隙灯观察结果相一致。临床上，角膜移植发生排斥反应时，我们不可能像其他器官移植一样取一小块组织进行活检，进行证实。因此，检测血清中细胞因子的变化可望成为判断角膜移植术后排斥反应的有无、程度及免疫抑制治疗疗效的一种方法。

【参考文献】
  [1] Holland EJ， Olsen TW， Sterrer J， et al. Suppression of graft rejection using 15-deoxyspergualin in the allogeneic rat penetrating keratoplasty model[J]. Cornea，1994，13(1)：28-32.

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[11] Daane CR， vanBesouw NM， vanEmmerik NK， et al. Discrepancy between mRNA expression and production of IL2 and IL4 by cultured graft in filtrating cells propagated from endomyocardial biopsies[J]. Transpl Int，1994，7(Suppl 1)：S627-628.

[12] vanEmmerik NK， Baan C， Vaessen L， et al. Cytokine gene expression profiles in human endmyocardial biopsy(EMB) derives lymphocyte culures and in EMB tissue[J]. Transpl Int， 1994，7(Suppl 1)：S623-626.

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