3  讨论

    视皮层是视觉系统的高级中枢，对弱视等与视皮层相关性眼科疾病的临床基础研究具有重要意义。通过对视皮层准确定位及原代培养，可以并且容易对研究的条件进行人为的控制，并保持相对恒定，进行一些在体内无法实施的研究内容。早在1991年Banker等[1]就在神经元培养的经典著作《Culturing Nerve Cells》中以视皮层为例较为详细地介绍了新生大鼠大脑皮层神经元的培养方法，这种方法在随后的眼科研究中得到了较为广泛的应用[2]。本实验视皮层的取材方法即参考此书，取得的组织主要为初级视皮层组织。

    神经元体外培养的成活率受许多因素的影响。一般来说，取材动物的年龄越小，成活率越高。多数培养的神经元取自胚胎动物，这主要是因为此时神经元的分离培养是在轴突和树突广泛分支发育之前，神经元不易在分离过程中受到损伤。并且在发育的早期阶段，神经元对靶细胞营养的依赖性较低，脑膜和结缔组织鞘膜也易于分离干净[3]。本实验视皮层取自新生大鼠而不是胎鼠也有其优点，例如节省动物，取材方便，鼠龄明确。且出生后大鼠中枢神经系统的神经元已经具有许多成熟的性质和特征，也已经能够较明确地辨别其各个解剖区域，所获得的组织定位更为可靠。

    目前，神经元的体外培养应用最多的是含血清的DMEM基础培养基，但由于多数培养基是根据非神经元的连续增殖营养所需而设计的，对神经元生长不大合适。并且在神经组织的分离细胞悬液中，一些非神经元细胞是无法完全去除的，包括神经胶质细胞、脑脊膜细胞以及成纤维细胞等[4]。由于这些细胞在体外能广泛增殖，所以在神经元的长期培养中一般要加入一定量的有丝分裂抑制剂如阿糖胞苷等以防止其过度增长[5]。而阿糖胞苷对神经元也有一定的毒性作用，可导致神经元的死亡。综合以上原因，我们在神经元培养的早期采用含新生牛血清、F-12 Nutrient Mixtures、谷氨酰胺的DMEM作为接种培养基。血清中既含有纤连蛋白、层黏连蛋白等介导细胞贴壁的因子，又含有多种营养物质，在加入了F-12 Nutrient Mixtures、谷氨酰胺等添加剂后营养更为全面，能够帮助神经元贴壁，并为其贴壁提供充足的能量。待细胞稳定贴壁后再将培养基逐渐过渡为Neurobasal Medium/B-27 Serum-Free Supplements无血清培养基进行维持培养。无血清培养基可以抑制非神经细胞的生长，尤其是成纤维细胞明显减少；神经细胞突起分化早、伸展快[6]。维持培养基专为培养神经元而设计，能够满足神经元的特殊营养需求，而胶质细胞等在其中不能够持续分裂增殖而逐渐死亡，因此能够纯化神经元。我们使用上述培养基培养的神经元状态良好，密度较高，非神经细胞数量不多，不添加阿糖胞苷也能够获得较高纯度的神经元。

    总之，我们对大鼠视皮层神经元原代培养在取材部位、时间的控制以及培养基的配制等方面进行了改进，不但可得到较高纯度的神经元，而且可使神经元生长的质量和数量达到比较理想的状态，满足实验的需要。

【参考文献】
  [1] Banker G, Goslin K. Culturing Nerve Cells[M]. Cambridge：The MIT Press，1991：227-249.

[2] XueTao B, Margaret TT, Wong R. Neuronal activity regulates protein and gene expressions of GluR2 in postnatal rat visual cortical neurons in culture[J]. J Neurocytol，2003,32(2):71-78.

[3] 郑志竑，林玲. 神经细胞培养理论与实践[M]. 北京:科学出版社，2002：77.

[4] Graham JM. Isolation of rat and human hippocampal neuron fractions in a discontinuous density gradient[J]. Scientific World Journal，2002，2(6):1634-1637.

[5] Berg DK, Fischbach GD. Enrichment of spinal cord cell cultures with motoneurons[J]. J Cell Biol，1978,77(4):83-98.

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