作者：陈雯，胡义珍，姜发纲，曾水清

    作者单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院 眼科，湖北 武汉 430022　基金项目：国家自然科学基金资助项目（30772382）

    《眼视光学杂志》2007年10月9卷5期 文章

    【摘要】  　　目的　 探讨高三尖杉酯碱（ｈｏｍｏｈａｒｒｉｎｇｔｏｎｉｎｅ，ＨＨＴ）对人视网膜色素上皮细胞（ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ，ＲＰＥ）增生的抑制及其细胞周期的影响。方法 　采用ＭＴＴ法检测５０％细胞生长抑制率时ＨＨＴ的药物浓度，并用此浓度作用于培养的人视网膜色素上皮细胞，用免疫细胞化学染色分析观察ＲＰＥ细胞的Ｋｉ－６７表达，流式细胞仪检测细胞周期变化。结果 　ＨＨＴ抑制培养的人色素上皮细胞的增生与药物剂量成正比，５０％细胞生长抑制率时ＨＨＴ的药物浓度约为４.７７ ｍｇ／Ｌ，Ｋｉ－６７阳性细胞率在对照组和ＨＨＴ组分别为８９.１％和３３.８％（Ｐ＜０.０１），两组中阳性细胞核积分光密度值分别为６０.７±５.７和２９.６±７.８（Ｐ＜０.０１）。流式细胞仪检测细胞周期变化示ＨＨＴ组Ｇ１期细胞比例由７２.１４％增至８３.９５％，Ｇ２?鄄Ｍ期细胞比例由１５.４６％下降至３.１８％。结论　 ＨＨＴ可抑制ＲＰＥ细胞的增生。ＨＨＴ作用后ＲＰＥ细胞中Ｇ０?鄄Ｇ１期细胞增多，Ｇ２?鄄Ｍ期细胞明显减少，ＨＨＴ对Ｇ２?鄄Ｍ期细胞有杀伤作用。ＨＨＴ有望成为防治视网膜脱离复位术后发生增生性玻璃体视网膜病变（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｖｉｔｒｅｏｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ，ＰＶＲ）的一种新药。

【关键词】  色素上皮　视网膜　细胞　培养　增生　高三尖杉酯碱　流式细胞术

　　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ rｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ iｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｈｏｍｏｈａｒｒｉｎｇｔｏｎｉｎｅ

    ＣＨＥＮ Ｗｅｎ， ＨＵ Ｙｉｚｈｅｎ， JIANG Fagang，et al.

    Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ， Ｕｎｉｏｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｔｏｎｇｊｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｗｕｈａｎ Ｃｈｉｎａ, ４３００２２

    ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ  To study the effect of homoharringtonine (HHT) on inhibiting proliferation and altering cell cycle in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) cells.  Methods  The effect of HHT on the proliferation of RPE was measured by the MTT method at concentrations of 0.001 mg/L、0.01 mg/L、0.1 mg/L、1 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、and 30 mg/L. The effect of HHT on the expression of Ki-67 in cultured human RPE cells was detected by immunohistochemistry at a 5 mg/L concentration. Flow cytometry was used to analyze the cell cycle. Results  The IC50 concentration of HHT was 4.77 mg/L. The relationship between the log concentration of HHT and the growth inhibition rate of RPE cells was linear. The proportion of the cells showing positive staining to Ki-67 in the control group and the HHT-treated group was 89.1% and 33.8% (P<0.01), respectively, and the integral optical density value for expression of Ki-67 in the two groups was 60.7±5.7 and 29.6±7.8 (P<0.01), respectively. The percentage of cells in the G1 phase of the cell cycle increased from 72.14% to 83.95%. The percentage of cells in the G2 phase of the cell cycle decreased from 15.46% to 3.18%.  Conclusion  HHT can inhibit the proliferation of RPE cells. Under its effect, RPE cells in the G0-G1 phase increased while those in the G2-M phase significantly decreased. HHT can kill RPE cells in the G2-M phase. It has the potential to become a new drug for PVR.

    ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ， ｒｅｔｉｎａ; ｃｅｌｌｓ， ｃｕｌｔｕｒｅｄ; ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ； ｈｏｍｏｈａｒｒｉｎｇｔｏｎｉｎｅ; ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ

　增生性玻璃体视网膜病变（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｖｉｔｒｅｏｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ，ＰＶＲ）是视网膜脱离复位术失败的主要原因，主要与视网膜色素上皮细胞（ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ, ＲＰＥ）的病理性增生有关。控制ＲＰＥ细胞的增生，促使ＲＰＥ细胞的凋亡，是防治ＰＶＲ的一种途经［１，２］。目前常用的玻璃体手术治疗难以防止术后再增生，应用的抗代谢药物（道诺霉素［３］、丝裂霉素Ｃ［４］、５－氟尿嘧啶［５］）因具有较强的毒副作用及不肯定的疗效而受到限制，寻找一种安全有效的药物是临床医生追求的目标。高三尖杉酯碱（ｈｏｍｏｈａｒｒｉｎｇｔｏｎｉｎｅ，ＨＨＴ）是我国所特有的一种中药，是从三尖杉植物——海南粗榧中提取的四种活性成分之一。本实验通过研究ＨＨＴ对人ＲＰＥ细胞增生及细胞周期的影响，探讨ＨＨＴ药物的作用机制，为ＨＨＴ应用于临床提供理论依据。

    １  材料和方法

    １.１  主要试剂  Ｄｅｌｂｅｃｃｏ改良的Ｅａｇｌｅ培养基（Ｄｅｌｂｅｃｃｏｎ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ，ＤＭＥＭ）干粉（Ｇｉｂｃｏ产品），胰蛋白酶（Ｄｉｆｃｏ产品），胎牛血清（Ｇｉｂｃｏ产品），高三尖杉酯碱（ＨＨＴ），鼠抗人细胞角蛋白（Ａｎｔｉ－Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ Ｐａｎ）单克隆抗体，鼠抗人Ｋｉ-６７单克隆抗体和链霉亲合素－生物素化过氧化物酶复合物（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｂｉｏｔｉｎ－ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ，ＳＡＢＣ）试剂盒（Ｂｏｓｔｅｒ产品）和ＤＮＡ染色试剂盒（Ｃｏｕｌｔｅｒ ＤＮＡ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ）（Ｃｏｕｌｔｅｒ产品）。

    １.２  方法

    １.２.１  人ＲＰＥ细胞的培养及鉴定  人ＲＰＥ细胞取自２０～３５岁意外死亡１２ ｈ内人的眼球，人ＲＰＥ细胞的分离、培养方法参见文献［６］，选第３～第６代细胞用于实验。细胞鉴定采用Ｂｏｓｔｅｒ公司试剂盒作角蛋白免疫组化检测：鼠抗人细胞角蛋白（Ａｎｔｉ－Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ Ｐａｎ）单克隆抗体作第一抗体，对照组用ＰＢＳ替代第一抗体，以ＳＡＢＣ法行免疫细胞化学染色。

    １.２.２  ＭＴＴ实验检测人ＲＰＥ细胞增生  取第３代ＲＰＥ细胞接种于９６孔板中，密度为１×１０５细胞／ｍｌ，每孔１００ ?滋ｌ，加入含１００ Ｕ／ｍｌ青霉素，１００ ｇ／ｍｌ链霉素，２０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养液培养２４ ｈ后将培养液换成含０.００１、０.０１、０.１、１、１０、２０、３０ ｍｇ／Ｌ七种浓度ＨＨＴ的２０％胎牛血清的ＤＭＥＭ液１００ ?滋ｌ，对照组为不含ＨＨＴ的等体积培养液，每个浓度设５个复孔，另设空白对照组。培养１２ ｈ后，更换成不含ＨＨＴ的培养液继续培养２４ ｈ，然后每孔加入５ ｇ／Ｌ ＭＴＴ ２０ ?滋ｌ，继续培养４ ｈ后，弃上清液，加入二甲亚矾１５０ ?滋ｌ，振摇１５ ｍｉｎ后，于酶标仪５５０ ｎｍ波长下测ＯＤ值，并以下列公式计算：细胞抑制率＝（空白对照组平均ＯＤ值－处理组平均ＯＤ值）／空白对照组平均ＯＤ值×１００％。ＨＨＴ５０％抑制浓度（ＩＣ５０）通过将药物浓度取常用对数后作自变量，细胞增殖抑制率作因变量，然后求出直线回归方程而得出。

    １.２.３  ＨＨＴ对人ＲＰＥ细胞Ｋｉ－６７表达的影响  将细胞接种于含玻片的１２孔板中培养２４ ｈ，换成含ＨＨＴ ５ ｍｇ／Ｌ的２０％胎牛血清的ＤＭＥＭ液培养，同时设不加药组作正常对照，培养１２ ｈ后撤药，加入２０％胎牛血清的ＤＭＥＭ液继续培养２４ ｈ，取出长有细胞的玻片固定，用鼠抗人细胞Ｋｉ－６７单克隆抗体作第一抗体，染色时设阴性对照组用ＰＢＳ替代第一抗体，ＳＡＢＣ法行免疫细胞化学染色。显微镜（×４００）下计数５个视野中阳性细胞数，计算阳性细胞数占细胞总数的比率。实验组与对照组每组选３张细胞标本，每张选取４８～５５个非边缘区的阳性细胞，采用ＭＰＩＡＳ－５００真彩色医学图像分析系统测定免疫组化片阳性细胞核的积分光密度（ＯＤ）。

    １.２.４  流式细胞仪分析人ＲＰＥ细胞周期  细胞以５×１０４细胞／ｍｌ密度接种，２４ ｈ后换成含ＨＴＴ（５ ｍｇ／Ｌ和５０ ｍｇ／Ｌ）的培养液培养同时设对照组，培养１２ ｈ后撤药，加入２０％牛血清的ＤＭＥＭ液继续培养２４ ｈ，消化收集细胞，用ＰＢＳ制成单细胞液，放－２０℃ 和７５％冰乙醇中固定，调整细胞密度为１×１０６／ｍｌ，取１００ ?滋ｌ样品加入等体积ＤＮＡ染液，室温放置２０ ｍｉｎ，流式细胞仪以４８８ ｎｍ激发光测定，每种浓度重复３次。

    １.２.５  统计学方法  数据采用ＳＰＳＳ １０.０软件包处理，将药物浓度取常用对数后作自变量，细胞增殖抑制率作因变量，求出直线回归方程。实验组和对照组人ＲＰＥ细胞的Ｋｉ－６７表达率采用?字２检验，Ｋｉ－６７表达阳性细胞核的积分光密度采用ｕ检验，流式细胞仪分析人ＲＰＥ细胞周期采用ｔ检验。

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