２  结果

    ２.１  细胞培养及鉴定  原代培养的细胞多呈多边形或扁形，胞浆内富含棕褐色颗粒，３～４周铺满。细胞传代２～３次后色素颗粒逐渐减少，消失，细胞呈梭形。阳性细胞角蛋白染色细胞染成棕黄色，呈纵横交错的网状结构。

    ２.２  ＨＨＴ对体外培养的人ＲＰＥ细胞的抑制能力与浓度的对数值呈线性关系。回归方程为Ｙ＝０.４２６＋０.１０９ ＬｏｇＸ，Ｙ为ＨＨＴ对体外培养的人ＲＰＥ细胞的抑制能力，Ｘ为ＨＨＴ浓度，ＩＣ５０时ＨＨＴ的浓度为４.７７ ｍｇ／Ｌ（见图１），回归系数经ｔ检验得，ｔ＝９.１９４，Ｐ＜０.０１。

    ２.３  ＨＨＴ影响人ＲＰＥ细胞的Ｋｉ－６７表达  阴性对照片隐约可见细胞核边界，细胞核未染色，细胞浆淡染（见图２）。正常对照组多数细胞呈阳性反应，即细胞核染为棕黄色，边界清楚，细胞核仁呈棕黑色，细胞浆色淡（见图３）。ＨＨＴ实验组细胞核染色明显变浅，细胞浆颜色变化不大（见图４）。显微镜下实验组计数的１４８个细胞中，阳性细胞占３３.８％，对照组显微镜下计数的１１０个细胞中，阳性细胞占８９.１％，两组间阳性细胞率差异有非常显著性（?字２＝７８.９２，Ｐ＜０.０１）。实验组与对照组分别检测阳性细胞数１４９和１５６个，阳性细胞细胞核积分光密度值分别为２９.６±７.８和 ６０.７±５.７，两组差异有非常显著性（ｕ＝３９.６１，Ｐ＜０.０１）。

    ２.４  流式细胞仪分析人ＲＰＥ细胞周期  ＨＨＴ作用后人ＲＰＥ细胞中Ｇ０－Ｇ１期细胞增多，与对照组比较差异有显著性（Ｐ＜０.０５）；Ｇ２－Ｍ期细胞明显减少，与对照组比较差异有非常显著性（Ｐ＜０.０１）（见表１）。

    ３  讨论

    高三尖杉酯碱（ＨＨＴ）是自三尖杉属植物中分离出来的生物碱，是我国所特有的一种中药，主要被用于治疗白血病，其治疗白血病的机制为对Ｓ期细胞杀伤较明显，可直接对核酸的结构与代谢发生作用，也可抑制蛋白质合成而干扰ＤＮＡ合成，导致细胞发生死亡。近来还有报道称ＨＨＴ可通过下调端粒酶活性而诱导白血病ＨＬ－６０细胞的凋亡［７~９］。过去我们在防治外伤性ＰＶＲ的实验研究中报道过，体外ＨＨＴ可显著抑制成纤维细胞增殖，它对结膜成纤维细胞产生５０％抑制效应的浓度为０.００５ ｍｇ／Ｌ，并且ＨＨＴ玻璃体注射不会导致正常眼组织的毒性损害［１０］。目前研究认为ＰＶＲ主要与ＲＰＥ细胞的病理性增生有关，因此控制ＲＰＥ细胞的增生，促使ＲＰＥ细胞的凋亡，是防治ＰＶＲ的一种途经［２，３］。本实验通过研究ＨＨＴ对ＲＰＥ的影响，为ＨＨＴ应用于临床防治ＰＶＲ提供理论依据。本次研究发现，ＨＨＴ可明显抑制ＲＰＥ的增生，它对ＲＰＥ细胞的生长抑制率与其浓度的对数成正比，它对ＲＰＥ细胞产生５０％抑制效应的浓度约为４.７７ ｍｇ／Ｌ，约为对成纤维细胞产生５０％抑制效应的浓度的一千倍，原因可能为ＲＰＥ细胞的增生能力较成纤维细胞弱。从ＨＨＴ对ＲＰＥ细胞表达Ｋｉ－６７的影响也可以看出ＨＨＴ可明显抑制人ＲＰＥ细胞的增生。从细胞生长周期看，ＨＨＴ对ＲＰＥ细胞的细胞周期影响一方面是使ＲＰＥ细胞集中在Ｇ１期，可能的机制是通过在Ｇ１期控制某种蛋白的合成而阻止ＲＰＥ细胞从Ｇ１期进入Ｓ期，从而使ＲＰＥ细胞周期延长，另一方面ＨＨＴ又使Ｇ２－Ｍ期细胞明显减少，可能的机制是ＨＨＴ对Ｇ２期细胞有杀伤作用，从而减少ＲＰＥ细胞进入分裂期，这两方面的共同作用达到了抑制ＲＰＥ细胞增生的目的。总之，ＨＨＴ是通过影响Ｇ１期和Ｇ２期来共同抑制ＲＰＥ细胞的增生。我们的下一步研究包括：ＨＨＴ可否诱导ＲＰＥ细胞的凋亡，ＨＨＴ在玻璃体内药代动力学研究以及使用治疗浓度时药物的安全性。

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