【摘要】　目的　了解视网膜内不同亚层对大分子物质的通透性差异。方法　将新鲜猪眼视网膜铺于自行设计的通透性装置上,Carboxyfluorescein (相对分子质量为376)和相对分子质量为4 400、9 300、19 600、38 900、71 200、150 000的F ITC2葡聚糖RPM I1640溶液置于视网膜的一侧, 1 h后,将视网膜取下进行冰冻切片,荧光显微镜下观察荧光分布情况,切片观察后固定并行苏木精2伊红染色。结果Carboxyfluorescein和不同相对分子质量的葡聚糖在正常猪眼视网膜的分布是不同的。无论Carboxyfluorescein接触视网膜内层还是外层,视网膜的内核层和外核层最亮;接触视网膜内层,相对分子质量为4 400葡聚糖组内核层最亮,相对分子质量为9 300～71 200 葡聚糖组内核层暗淡而内核层以前较亮,相对分子质量为150 000葡聚糖组内丛状层以前部分较亮;接触视网膜外层,相对分子质量为4 400葡聚糖组视网膜全层均明亮,但外核层以外最亮,而相对分子质量为9 300～150 000葡聚糖组则仅外核层明亮,其余层均暗淡。结论　内核层和外核层是视网膜内主要的大分子通透屏障,大分子通透上限排序(由小到大)依次为外核层<内核层<内、外丛状层<神经纤维层和内界膜。

　　玻璃体内药物注射是眼科常用的治疗手段,大分子药物(如血管内皮生长因子抗体Avastin、Lucentis等)也被越来越多的使用[ 123 ] ,但有关大分子药物眼内代谢的研究却较少。神经视网膜分为9 个亚层,是与玻璃体接触面积最大的部分,大分子药物注射到玻璃体内后,很大一部分要向视网膜扩散,而已有文献关于视网膜不同亚层对大分子通透性差异的研究报道较少,因此,本研究使用与人眼视网膜解剖结构相近的猪眼视网膜和自行设计的通透实验装置对此进行研究。

    1　材料与方法

    1. 1　材料　从屠宰场获得新鲜尸体猪眼(处死后不超过3 h,温度低于10 ℃,取得后立即置于4 ℃冰箱,实验时间距处死不超过6 h) 。将猪眼球从角膜缘后6 mm处环形切开,前段组织被剔除,轻柔地将玻璃体从视网膜表面分离。使用光滑的玻璃棒将视网膜从外壁分离后浸泡于RPM I 1640 细胞培养液(包括5 958 mg·L - 1 HEPES, 100 U·mL - 1青霉素和100μg·mL - 1链霉素, pH 7. 4,天润善达公司,中国) ,将视网膜贴附于20 ～25 μm 孔径无灰滤纸(No. 541;Whatman,Maidstone,UK) 。

    1. 2 　荧光标记物和样本获取　Carboxyfluorescein(相对分子质量376 )和不同相对分子质量的F ITC2dextran (绿色荧光标记的葡聚糖)被用于本实验,葡聚糖的相对分子质量分别为4 400、9 300、19 600、38 900、71 200和150 000 ( Sigma2Aldrich, St. Louis,MO) 。我们选择部分样品进行凝胶过滤层析来验证无游离的荧光集团F ITC存在。1 h通透实验后,视网膜组织从装置上取下,包埋剂固定冷冻,冰冻切片机切片(CM1900; Leica,Wetzlar,德国) ,厚6 μm,荧光显微镜观察照相(DFC300 FX;莱卡,剑桥, UK) 。随后,切片浸入体积分数为4%甲醛10 min,进行苏木素2伊红染色。

    1. 3　体外通透实验装置　我们自行设计了体外通透实验装置(图1) ,材料为无磁性不锈钢,室间孔的直径为4 mm。首先,直径8 mm的视网膜(同滤纸贴附)放置于装置的底座中央(图1A) ,内界膜朝上或朝下,然后对准底座上的凹槽,上部小室(图1B)通过重力将视网膜片固定,使用氰基丙烯酸盐黏合剂封闭边缘。包含1 mmol·L - 1 Carboxyfluorescein和011 mmol·L - 1 F ITC2dextran的RPM I 1640细胞培养液1 mL被加入上部小室, 40 mL RPM I 1640细胞培养液被加入外部小室(图1C～E) 。2个小室的液平面保持在同一水平。整个实验的环境温度为25 ℃,避免周围光线照射。为了验证这种方法的可行性和装置的密闭性,我们使用了防水塑料膜和尸体猪眼视网膜进行预实验。结果显示装置密闭,上部小室的液体不会通过联合部外渗。

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