2　结果

    在F ITC2dextrans溶液中没有检测到游离的荧光集团。内界膜面朝上时,经过1 h的通透实验, Car2boxyfluorescein和不同相对分子质量的葡聚糖在正常猪眼视网膜的分布不同(图2 ) 。荧光显微镜下,荧光标记分子密度最高的亚层亮度最大:内界膜面朝Figure 1 　Apparatus used in the study was made of nonmagneticstainless steel　本研究中使用的通透实验装置,材料为无磁性不锈钢上, Carboxyfluorescein在视网膜的内核层和外核层聚集(图2A) ,内界膜面朝下时,分布相似(图2B) ;内界膜面朝上,相对分子质量为4 400葡聚糖在内核层聚集(图2C) ,相对分子质量为19 600葡聚糖被阻挡在内核层以前(图2E) ,相对分子质量为150 000葡聚糖被阻挡在内丛状层以前(图2G) ,内界膜面朝下,这3种相对分子质量不同的葡聚糖基本被阻挡在外核层以外(图2D、2F、2H) 。

    3　讨论

    本实验的原理如下:如果F ITC2葡聚糖分子足够小,能够自由通过全层视网膜,那么荧光标记分子的密度在视网膜的通透屏障层会最高,在荧光显微镜下观察的亮度最强。但是当F ITC2葡聚糖分子较大,不能通过全层视网膜时,这些大分子将被阻挡在第一个通透屏障前,这个屏障在荧光显微镜下观察相对较暗。使用Carboxyfluorescein (相对分子质量376)进行通透实验发现内核层和外核层最亮,这表明内核层和外核层是通透的“瓶颈”。相对分子质量为4 400的F ITC2葡聚糖从视网膜内层向外层弥散时,内核层是最亮的,而外核层是暗的,这表明相对分子质量为4 400 F ITC2葡聚糖,外核层是通透屏障而不是内核层。相对分子质量为9 300～71 200的F ITC2葡聚糖从视网膜内层向外层弥散时,内核层不亮,而内核层以前的部分是亮的,这表明对于相对分子质量为9 300～71 200 F ITC2葡聚糖而言,内核层是通透屏障,而内核层以前的内丛状层、神经纤维层、神经节细胞层和内界膜都不是。相对分子质量为150 000 F ITC2葡聚糖从视网膜内层向外层弥散时,神经纤维层是最亮的,而后其他层是暗的。这表明对于相对分子质量为150 000 F ITC2葡聚糖而言,内丛状层和神经节细胞层是通透屏障,而神经纤维层和内界膜不是。由此,可以对视网膜不同亚层的大分子通透屏障功能进行排序。大分子通透性由小到大依次为外核层<内核层<内、外丛状层<神经纤维层和内界膜。

    不过,由于这些结果只是在荧光显微镜下肉眼评价进行图像对比得出,因此Jackson等[ 4 ]进行类似的F ITC2葡聚糖通透实验,通透时间为24 h,当葡聚糖接触到视网膜内侧面时,相对分子质量为167 000F ITC2葡聚糖主要聚集在内丛状层,而当葡聚糖接触到视网膜外侧面时,相对分子质量为167 000 F ITC2葡聚糖主要聚集在外丛状层。因此,他们认为,内丛状层和外丛状层是阻挡大分子物质通透视网膜的主要屏障。在本实验中,我们增加更小相对分子质量F ITC2葡聚糖通透实验,发现视网膜的内外核层才是真正的屏障层,而不是丛状层。我们的另一项研究表明即使视网膜内层因为水肿而失去屏障功能,视网膜整体也仍能保持强的大分子屏障能力,这也间接证实外核层是最强的屏障层[ 5 ] 。

    无论视网膜内层还是外层接触Carboxyfluoresce2in或相对分子质量为4 400 F ITC2葡聚糖,神经节细胞层都是亮的。但是,由于神经节细胞核为单层,排列不紧密,因此大分子能够从神经节细胞核之间的空隙穿过,所以神经节细胞核尽管对于葡聚糖存在屏障作用,在荧光显微镜下表现为亮的,但是神经节细胞层作为一个整体不是通透屏障。

    本研究的一个缺陷在于不能评价外界膜的通透功能,做为光感受器细胞核和Müller细胞间的连接,外界膜是视网膜的重要一层。曾有一项兔眼视网膜研究表明外界膜是白蛋白跨视网膜通透的屏障[ 6 ] 。此外,由于本实验除了建立动物模型外,基本是在体外进行,所以不能真实反映活体视网膜细胞对大分子物质的主动转运情况,这也是本实验另一个缺陷。我们的发现可能有助于解释一些临床现象:高血压视网膜病变和糖尿病视网膜病变可以存在硬性渗出,为血清和胶质的崩解产物,定位于外丛状层,临床上常观察到硬性渗出的吸收需要数月。由于硬性渗出的成分为大分子物质,如果如本研究发现,外核层和内核层是体内大分子物质通过视网膜的主要屏障,那么处于外核层和内核层之间的外丛状层硬性渗出的弥散速度就会较慢,硬性渗出的吸收则缓慢。位于视网膜浅层的出血,如继发于视网膜静脉阻塞的出血,常呈长条形或火焰状;而继发于高血压视网膜病变的视网膜深层出血,位于内核层,常为小点状或圆点状,形态上较视网膜浅层出血要小。可能由于内核层是重要通透屏障,血细胞更难扩散。

    有些基础研究的结果和临床所观察到的药物疗效相悖。玻璃体内注射Avastin后,绝大多数湿性老年黄斑变性( age2related macular degeneration, AMD)患者视力提高、视网膜厚度降低、荧光渗漏减轻,这
说明Avastin可以通过视网膜而到达脉络膜新生血管部位起到治疗作用[ 223, 7210 ] ; 但是动物实验研究却发现这种全长抗体(相对分子质量148 000)不能通过恒河猴视网膜[ 11 ] 。这可能由于AMD患者的大分子通透上限比正常人要大的多。在某些退行性视网膜病变患者,例如视网膜色素变性以及AMD患者,主要是视网膜外核层发生损害;如果视网膜外核层是主要通透屏障,就能很好的解释视网膜整体的通透极限升高,能够通过视网膜的分子直径增大。本研究是基于正常视网膜而得出的结论,有关病理状态下视网膜对大分子通透性的研究较少[ 12 ] ,还有待进一步深入探讨。

    参考文献

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