作者单位：上海交通大学医学院附属瑞金医院 眼科，上海 200025

《眼视光学杂志》2008年2月10卷2期 文章

【摘要】  目的 探讨慢性高眼压大鼠视神经中小胶质细胞/巨噬细胞的激活分布情况。方法 结扎两条巩膜上静脉建立慢性高眼压大鼠模型，应用OX-42单克隆抗体行免疫组化检测视神经中小胶质细胞/巨噬细胞的激活分布情况。结果 对照眼视神经中小胶质细胞/巨噬细胞呈圆状、柱状，无明显树突样突起；慢性高眼压眼视神经中小胶质细胞/巨噬细胞呈阿米巴状、柱状，有树突样突起，细胞数量增加，术后第1周，视神经中小胶质细胞/巨噬细胞数量为49.61±8.04/3个400倍视野。此后视神经中小胶质细胞/巨噬细胞数量逐渐减少。术后第1周至第8周视神经中小胶质细胞/巨噬细胞的数量与同期对照眼相比差异有显著性（P<0.05）。术后第12周，视神经中小胶质细胞/巨噬细胞的数量与同期对照眼相比差异无显著性（P>0.05）。结论 慢性高眼压可致视神经中小胶质细胞/巨噬细胞激活，细胞数量增加，但随时间延长逐渐降低。

【关键词】  慢性高眼压大鼠 视神经 小胶质细胞 巨噬细胞 OX-42 激活

    新近研究表明，免疫因素参与了青光眼视神经病变的病理生理过程[1]。神经胶质细胞，主要是小胶质细胞，一直以来被认为有传递抗原的作用，并与中枢神经系统免疫病理的发生、发展有关。作为中枢神经系统的组织巨噬细胞，小胶质细胞在多种自身免疫性神经退行性疾病（如阿茨海默氏病）的病理过程中有关键的调节和影响作用[2]。青光眼视神经中的小胶质细胞亦很有可能参与了青光眼的免疫病理过程[1]。小胶质细胞在青光眼视神经损害过程中的激活和分布及其作用目前尚未完全明了。本实验主要探讨慢性高眼压大鼠视神经中小胶质细胞/巨噬细胞的激活分布情况，为进一步研究其在青光眼视神经损害中的作用提供实验基础。

    1  材料与方法

    1.1  实验动物  雄性健康纯种Sprague-Dawley（SD）成年大鼠28只，体重200~250 g，由上海宝牧实验动物养殖场提供，生产许可证号码：SCXK（沪）2004-0007，使用许可证号码：SYXK（沪） 2003-0026。裂隙灯检查屈光间质清晰，直接眼底镜检查眼底正常。饲养环境：光照早晨6点至晚上6点，室温18~25℃。左眼为实验眼，右眼作为对照。

    1.2  巩膜上静脉结扎建立慢性高眼压模型  按30 mg/kg自腹腔注入3%的戊巴比妥钠对大鼠进行麻醉后，用0.5%爱尔卡因滴眼液表面麻醉1次。行常规眼部消毒，上、下眼睑缝线开睑，于该眼的1：00方位的角巩膜缘处，平行于角巩膜缘方向剪开球结膜和其下方的Tenon囊，每条切口长约3 mm。沿切口的两端行结膜和Tenon囊放射状切开，并向后分离直到找到该处的巩膜上静脉，用10-0尼龙线将其结扎，结扎成功的标志是血管远端血流中断。同样方法结扎4：00方位的巩膜上静脉。术后结膜囊内涂红霉素眼膏封眼。对侧眼做同样切口及分离球结膜但不予结扎巩膜上静脉，作为对照眼。

    1.3  眼压（intraocular pressure，IOP）测量  术前和术后每周2次用Goldmann压平眼压计（鼠用型）进行双眼IOP测量，所有眼压测量均为同一操作者完成，测量在暗室内进行，时间在18：00~20：00。IOP测量前，用3%戊巴比妥钠对大鼠进行腹腔麻醉（25 mg/kg），由专人将大鼠固定于自制大鼠固定器上，置于裂隙灯架前进行IOP测量并记录。连续测量3次，取平均值，每次测量间隔时间为3 min，3次IOP测量值之间相差不超过3 mmHg。

    1.4   动物处理和取材  将成模的15只慢性高眼压鼠分别分成术后1、2、4、8、12周组，每组3只。按组别完成眼压、眼前段观察及眼底照片后，予过量戊巴比妥钠对大鼠进行腹腔注射处死大鼠，摘取双眼眼球并尽可能包含较长的眶内段视神经，并置于10%福尔马林溶液中固定48 h以上。眼球固定后，在解剖显微镜下紧贴巩膜表面剪下视神经。按常规石蜡切片方法将视神经梯度脱水、透明、定向包埋和切片（厚5 ?滋m）。

    1.5  免疫组化染色  切片常规脱蜡复水，3％H2O2室温处理10 min；用TBS缓冲液（0.05M，pH7.6）清洗切片3次，每次2 min；柠檬酸溶液（0.01M， pH6.0）1500 ml高压沸煮90 s修复抗原；TBS缓冲液清洗切片3次，每次5 min。加入OX-42小鼠抗大鼠单克隆抗体（1：100，英国Abcam公司）于4°C冰箱过夜。用TBS缓冲液清洗切片3次，每次    5 min。加入Ⅱ抗（羊抗小鼠IgG，美国KPL公司）室温处理30 min；TBS缓冲液清洗切片3次，每次   5 min；滴加新鲜配制的DAB溶液（武汉博士德生物工程有限公司），在显微镜下观察掌握染色程度，待出现阳性染色颗粒时，立即放入清水漂洗终止显色。苏木素复染，脱水，透明，封片。

    1.6  阅片及图像分析  阅片采用Axioskop 2 Plus 生物显微镜，放大倍数为400×，观察OX-42阳性细胞的形态及分布情况。用Image-Pro Plus图像分析软件进行分析，分别对术后1、2、4、8、12周组的双眼视神经OX-42表达阳性的细胞密度进行分析。每张切片随机取视神经周边区、旁中心区和中心区3个视野，计数3个视野中OX-42阳性细胞的的数量。

    1.7  统计学方法  本实验的所有数据均以数据库文件形式贮存于磁盘上，采用SPSS for Windows，Ver 13.0.4软件在计算机上进行统计处理，统计方法为配对t检验。

    2  结果

    2.1  眼压  28只SD大鼠中有15只实验眼IOP较对侧眼有不同程度的升高。随着术后观察时间的延长，实验眼的IOP逐渐下降，至术后第8周，实验眼IOP维持在24 mmHg以上，与同期对照眼相比，差异具有显著性（P<0.001）；但术后第8周以后，实验眼IOP已降至20 mmHg左右，与对侧眼IOP间差异已无显著性（P>0.05）。

    2.2  视神经小胶质细胞/巨噬细胞的激活情况  对照眼视神经可见少许小胶质细胞/巨噬细胞着染，分布稀疏，细胞形态呈圆状、柱状，无明显树枝状突起（见图1A）。术后第1周和第2周，实验眼视神经小胶质细胞/巨噬细胞数量明显增加，细胞体积增大，细胞多呈阿米巴状和柱状，有树枝状突起（见图1B，1C）；术后第4周和第8周，实验眼视神经小胶质细胞/巨噬细胞数量较第1周和第2周逐渐减少，细胞仍呈阿米巴状和柱状，可见树枝状突起（见图1D，图1E）；术后第12周，实验眼视神经小胶质细胞/巨噬细胞分布稀疏，细胞呈柱状和圆形，突起少（见图1F）。

    2.3  视神经小胶质细胞/巨噬细胞细胞计数  术后第1周至第12周视神经OX-42阳性染色细胞数见表1。从表中可以看出，术后第1周，实验眼视神经OX-42阳性染色细胞数明显增加，与对照眼相比差异有显著性（P<0.05）。术后第2周至第8周，随着实验时间的延长，视神经OX-42阳性染色细胞数逐渐减少，但与同期对照眼相比差异仍有显著性（P<0.05）。术后第12周，实验眼神经OX-42阳性染色细胞数与对照眼相比差异无显著性（P>0.05）。

    3  讨论

    3.1  大鼠小胶质细胞的表达标记物  小胶质细胞最显著的特点之一是对外界环境刺激非常敏感。在微环境发生变化时，小胶质细胞可迅速作出反应，开始大量表达一些与抗原识别和提呈有关的特异性膜表面分子，如主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex，MHC）和补体受体CR3[3]。补体受体CR3是由α、β两条肽链以非共价键结合而构成的异二聚体糖蛋白，分子量分别为165kDa和95kDa，CR3的α链为CD11b，β链为CD18[3]。大鼠和小鼠的视神经小胶质细胞表达OX-41，OX-42，OX-3，OX-6，OX-18，EDI，MACI，F4/80等[4]。OX-42为CD11b单克隆抗体，当小胶质细胞激活并大量表达CR3时，OX-42能够与CR3的α链（CD11b）发生抗原抗体反应。Lam等[5]单纯应用OX-42单克隆抗体来标记大鼠视神经和视网膜中的小胶质细胞，但巨噬细胞亦有OX-42的表达[6]，因此OX-42单克隆抗体标记的细胞应包含有小胶质细胞和巨噬细胞，故本研究所检测到的细胞应为小胶质细胞/巨噬细胞。

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