眼科研究 2000年第3期第18卷 实验研究
作者：罗燕 唐仕波 林少芬 杨斌 郑湖玲
单位：510060 广州，中山医科大学中山眼科中心
关键词：纯感光细胞；准分子激光；酶消化；视网膜移植
摘要 目的探讨改进获取视网膜纯感光细胞的方法。方法应用改良的准分子激光切削法和酶分层消化法来分离纯化视网膜感光细胞层。结果由两种方法获取的视网膜组织片经苏木素－伊红染色均证实为单一的纯感光细胞层并保持生物活性。结论改良的准分子激光切削法和酶分层消化法均能获取视网膜纯感光细胞，且对细胞损伤小，内外节段保持完好，可为视网膜的移植创造条件。
分类号 R774
A study on the purification of retinal photoreceptors
Luo Yan，Tang Shibo，Lin Shaofen
（Zhongshan Ophthalmic Center，Sun Yat-sen University of Medical
Sciences，Guangzhou 510060）
Abstract：Objective：To investigate methods for isolation of the pure retinal photoreceptors.MethodsModified excimer laser surgery，regular excimer laser surgery， and enzyme gradation digestion were used to isolate retinal photoreceptors.The resulting retinal tissues were stained with hematoxylin-eosin（HE）.Results：The retinal sheets obtained by these three methods each demonstrated a layer of pure photoreceptors by HE staining.Modified and regular excimer laser surgery could both precisely ablate retina.Modified excimer laser ablation obtained photoreceptor sheets with perfect inner and outer segment，while regular excimer laser ablation got photoreceptor sheets with impaired inner and outer segment.Enzyme gradation digestion could also result in photoreceptor sheets with good inner and outer segments，although there was non-precise digestion.Conclusion：Modified excimer laser surgery and enzyme gradation digestion can be used to obtain a layer of pure photoreceptors with good tissue preservation；specially perfect inner and outer segment.These cells may be a source for retinal transplantation.
Key words pure photoreceptors laser surgery enzyme digestion retinal transplantation
近10年来，视网膜移植的研究已取得了长足的进步，其中研究较多的是色素上皮细胞和感光细胞的移植。对感光细胞变性的眼病，移植纯的感光细胞则更有针对性，且更能正确对位移植，避免玫瑰花结构的形成。但是目前分离纯化和鉴定视网膜感光细胞仍存在一定的困难，获取视网膜纯感光细胞的方法主要有两种：组织细胞震动切削机切削法和准分子激光切削法。本研究比较了不同眼球来源的感光细胞的取材并改良了获取视网膜纯感光细胞的方法，结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料来源
材料来源包括角膜移植后的成人眼球、治疗性引产的8～9个月胚胎人眼、屠宰场提供的猪眼、新西兰兔眼、成年SD大鼠眼，以上均在死后24h以内取材。
1.2 视网膜取材
在角巩缘后4mm处平行角膜缘环行剪开眼球，去除眼前节部分，用镊子将玻璃体剥除，钝性分离视网膜神经上皮层和色素上皮层，在视乳头处剪断，游离出完整的视网膜神经上皮层，置于D-Hank’s液中漂洗干净其上的色素及色素上皮细胞，按象限四分视网膜神经上皮层（SD大鼠的视网膜除外)。
1.3 感光细胞的分离和纯化
1.3.1 改良的准分子激光切削法：经过摸索，我们改进了准分子激光切削视网膜的过程，将人、兔、猪和鼠眼的视网膜神经上皮层的感光细胞层朝下平铺在35mm的塑料培养皿上，吸净培养皿中和视网膜表面的D-Hank’s液。选用波长为193nm的准分子激光仪（Keracor217型，美国CHIRON公司)。将瞄准指示光聚焦于所要切削的视网膜处，选调其工作参数：能量密度120mJ／cm2，频率50Hz，激光发射采用光性治疗性角膜切削术（phototherapeutic keratectomy，PTK)模式，切削直径3mm，切削深度在视网膜后极部为63～65μm。为了对比，我们同时参照国内外一些学者的方法［1，2］，即将视网膜平铺在20%的明胶托上，滴5%的明胶液（35℃）于明胶托上使视网膜漂浮起来，然后在5%的明胶重新凝固前迅速将其吸出，静置5min使视网膜牢固粘贴于20%的明胶托上，再用准分子激光作同样的切削。
1.3.2 酶分层消化法：即将视网膜神经上皮的内层用酶学方法消化去除，剩下纯的感光细胞层。将备用的人、兔、猪眼的视网膜感光细胞层朝上平铺在1mm×1mm孔径的不锈钢筛网上后，再放在玻璃培养皿中，靠近筛网加入含2.5%胰酶、0.4%EDTA和0.2%胶原酶的消化液刚好至筛网表面，利用筛网的蔓延作用使消化液全面接触朝下的视网膜内层，于37℃孵育约1h(胚眼组织则为45min），其间在筛网下用消化液轻轻吹打视网膜内层3次，最后用含10%的胎牛血清的培养液终止酶的消化作用，并在筛网下面轻柔反复地吹打已消化松脱的视网膜神经上皮层的内层组织，收取筛网上的纯视网膜感光细胞层。
1.4 HE标本制作
小心仔细地将上述方法所得的菲薄的视网膜组织片(有明胶固定的组织片连同明胶一起)置于10%的中性缓冲福尔马林液固定、系列梯度酒精脱水、石蜡包埋、切片、苏木素-伊红染色（hematoxylin-eosin，HE）、光镜下观察。
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