2　结果

　　由改良的准分子激光切削法和酶分层消化法获取的视网膜组织片经苏木素－伊红染色，并与正常的视网膜标本进行对照，结果均显示为单一的纯感光细胞层并具有内外节段，可用于视网膜纯感光细胞移植研究中。改良的准分子激光切削法能精确地切削去除视网膜内8层结构，只剩下完整的外核层即感光细胞胞核所在(图1)，且锥杆细胞的内外节段保持良好(箭头所示)。本研究发现人、兔、猪和鼠眼材料来源的视网膜所用的激光切削参数都相同，视网膜后极部血管分布区的切削深度为63～65μm，这与Dowling^［3］报道的大多数脊椎动物视网膜的结构和厚度都基本一致的理论相符，切削参数的确定也极大方便日后进行多种种属视网膜感光细胞移植供体的取材。酶分层消化法虽不能精确地将视网膜消化至只剩完整的外核层，但也可得数量较多的感光细胞(图2)，也仍具较好的内外节段(箭头所示)。各种材料来源的视网膜所用酶的浓度和作用时间也都相同，但胚眼组织消化时间则可短些，因为胚胎组织细胞间的连接较成年组织的疏松。而所用明胶粘贴固定的视网膜经激光切削后同样可获得纯感光细胞层(图3)，但其内外节段因接触粘附在明胶中，已模糊不清，无法辨认，明显受损(箭头所示)。(图1～3见237页)

　　3　讨论

　　分离出足够数量和纯的感光细胞以替代患眼功能不全或已遭破坏的感光细胞是视网膜感光细胞移植最关键的第一步。为使移植细胞能更好发育和存活，分离时应尽可能减少对细胞的损伤。早在1988年Townes-Anderson等^［4］就用酶分离的方法获得兔视网膜的视杆细胞，但此法所得的是视网膜多种细胞的混悬液，且也破坏了感光细胞层的正常组织结构和细胞极性，感光细胞活性差。

　　最近国内外已有用准分子激光更精确地切削视网膜，获得成片纯感光细胞的报道^［1，2］，但他们都是用明胶作为包埋粘贴剂，移植时连同明胶一起移植到视网膜下腔，这样获取的感光细胞，从本文结果看内外节段大多受损，而且妨碍了感光细胞和色素上皮细胞的尽快接触，不利于感光细胞移植后的存活和功能恢复。

　　另外，还有人采用组织细胞震动切削机切削法从视网膜上获取纯感光细胞层^［5～7］。同样利用两种不同浓度的明胶来包埋粘贴固定待切削的外核层朝下的视网膜片，再用组织细胞震动切削机以20～60μm的厚度切削视网膜，直至切下的组织用美蓝染色后在显微镜下检查证实刚达感光细胞层为止。此法除存在与常规准分子激光切削用明胶作为包埋粘贴剂的缺点外，其操作繁琐、耗时，且震荡切削力对感光细胞也可能造成较严重的损伤^［8］。

　　本研究中我们利用视网膜结构层次分明的特点和不锈钢筛网为视网膜薄片的支架，经反复摸索酶的浓度和作用时间，首次提出了酶分层消化法可获得纯视网膜感光细胞。这种方法操作时间较长，但对仪器设备要求不高，费用低，在不具备准分子激光仪的条件下值得推广应用。我们改良的准分子激光切削法省略了明胶粘贴固定的复杂程序，并避免了明胶粘固对内外节段的破坏，所得的视网膜感光细胞层植片具有完好的内外节段，且没有明胶粘附，植入到视网膜下腔后，可立即与色素上皮细胞正常接触，便于移植感光细胞功能的恢复与发挥。改良的准分子激光切削法在简化操作步骤、缩短操作时间及减少细胞的破坏等方面较常规的准分子激光切削法有显著的改善。

　　本研究两种方法所获得的视网膜感光细胞的内外节段仍存在，提示其所受损伤较小，为视网膜的移植创造了条件，至于其进一步的功能状况及生物学活性，我们目前正在研究中。

图1　改良的准分子激光切削法获取的感光细胞组织片，箭头示完好的内外节段(HE×400)　图2　酶分层消化法获取的感光细胞组织片，箭头示较好的外节段(HE×400)　图3　常规明胶粘固的视网膜经激光切削后的感光细胞组织片，箭头示受损的外节段(HE×400)　Fig．1　Photoreceptor　sheets　ablated　by　modified　excimer　laser

　　surgery　arrows　indicate　photoreceptors　with　perfect　inner　and　outer　segment(HE×400)　Fig．2　Photoreceptor　sheets　obtained　by　enzyme　gradation　digestion

　　arrows　indicate　photoreceptors　with　good　inner　and　outer　segment(HE×400)　Fig．3　Photoreceptor　sheets　ablated　by　regular　excimer　laser

　　surgery　arrows　indicate　photoreceptors　with　impaired　inner　and　outer　segment(HE×400)

　　本课题获国家自然科学基金基金编号：39770790及广东省自然科学基金基金编号：950329资助

　　1，马美云，王薇，陈越国，等.准分子激光切削视网膜板层移植术.中华眼底病杂志，1998，14（4）∶209

　　2，Huang JC，Ishida M，Hersh P，et al.Preparation and transplantation of photoreceptor sheets.Curr Eye Res，1998，17（6）∶573

　　3，Dowling JE，著.吴淼鑫，杨雄里，译.视网膜.上海：上海医科大学出版社，1989.8－14

　　4，Townes-Anderson E，Dacheux RF，Raviola E.Rod photoreceptors dissociated from the adult rabbit retina.J Neurosci，1988，8（1）∶320

　　5，Silverman MS，Hughes SE.Transplantation of retinal photo-receptors to light-damaged retina.Invest Ophthalmmol Vis Sci，1989，30∶1684

　　6，姜德咏，高玲.视网膜移植抗原性的初步研究.中华眼底病杂志，1997，13（4）∶234

　　7，Kaplan HJ，Tezel TH，Berger AS，et al.Human photoreceptor transplantation in retinitis pigmentosa.Arch Ophthalmol，1997，115∶1168

　　8，Tezel TH，Kaplan HJ.Harvest and storage of adult human photoreceptor cells：the vibratome compared to the excimer laser.Curr Eye Res，1998，17（7）∶748

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