摘要　目的 探讨角膜中期保存过程中细胞凋亡现象，为改进角膜保存方法提供理论 依据。方法 采用M-K液、M-K＋EGF液和Optisol3种保存液保存兔和人角膜，用光镜、电镜及TUNEL标记技术检测细胞凋亡发生情况。结果 3种保存液保存3、5 、7天的兔角膜，在上皮、基质及内皮细胞层均可见典型的细胞凋亡发生。保存时间不同， 保存液不同，TUNEL阳性细胞数不同。M-K液和Optisol液保存4天的人角膜同样可 见细胞凋亡发生。结论 细胞凋亡是角膜中期保存过程中细胞丧失的另外一种可能机制； 细胞 凋亡的发生对角膜中期保存效果存在一定的影响；表皮生长因子在角膜中期保存过程中没有 阻止角膜细胞凋亡发生的作用。

Preliminary study on the a poptosis in the mid-term storaged corn eas

Zhong Xingwu　Gong Xiangming　Yang Pei zeng

　　（Zhongshan Ophthalmic Center，S un Yat-sen University

　　of Medical Scienc es ，Guangzhou 510060）

　　Abstract ObjectiveTo examine apoptosis in mid-term storaged corneas，so as to provide theoretical bas is for improving the method of corneal s torage．Methods Rabbit and human cornea s were stored in M-K liquid，M-K liquid wit h epidermal growth factor（EGF）（10ng／ml） and optisol liquid．Morphological study was performed by light microscope and el ectron microscope on the occurrence of a poptosis at 3，5，7 d after the corneas we re preserved in three kinds of liquids．Q uantitative study was also performed on the occurrence of apoptosis at different time by TUNEL and light microscope．Res ults The characteristic apoptotic c ells were observed by light microscope a nd electron microscope in corneal epithe lium，stroma，and endothelium when corneas were preserved in three kinds of liquid s after 3，5，7d．TUNEL-positive cells inc reased evidently when prolonged the time of corneal storage in three kinds of li q uids （P＜0.01)．TUNEL-positive cells of co rneas had no differences between preserv ation in M-K liquid and in M-K liquid wi th EGF（P＞0.05），but TUNEL-positive cells were significantly higher than that of preservation in optisol liquid （P＜0.01)． Apoptotic cells were also observed in hu man corneas that preserved in M-K and op tisol liquid for 4d．ConclusionsThe r e sults indicate that apoptosis may be ano ther mechanism of cell death in corneal storage and apoptosis that influences th e quality of mid-term corneal storage．M- K liquid with added EGF has no significa nt differences in preventing the apoptos is of cornea in mid-term liquid．

　　Key words　corneal storage corneal cellsapoptos is

　　角膜保存的质量与时间仍然是限制我国角膜移植复明手术开展的关键。如何提高角膜保存的质量与延长角膜保存的时间，实际上关键在于延缓角膜细胞，特别是角膜内皮细胞在体外条件下的死亡过程，尽可能长时间维持细胞的正常生理功能。近来的研究表明，细胞的死亡包括坏死与凋亡两种截然不同的方式。那么，角膜中期保存过程中细胞的丧失有无细胞凋亡的参与对于这个问题，国内外均未见报道。如果回答是肯定的，我们就可以从调控细胞凋亡的角度来探讨改良角膜保存的方法。为此，我们进行了以下的研究。

　　1　材料与方法

　　1．1　角膜中期保存液 的准备

　　M-K(McCarey-Kaufman)液的配制：每1000ml组织培养液TC-199中加入低分子右旋糖酐(分子量40000，Sigma Chemical Company U．S．A）50g，0.025mol／L的HEPES以及碳酸氢钠2.2g，调pH值为7.4，渗透压290mmol／L，滤菌膜抽滤除菌后备用。

　　M-K＋EGF(epide rmal growth factor，EGF)液：在以上M-K液中加入EGF(Boe hriger Mannheim，Germany)使其终浓度为10ng／ml。

　　Optisol保存液：购于美国(Chiron Vision，U．S．A）。

　　1．2　实验动物分组与角膜保存

　　纯种新西兰白兔(中山医科大学动物 实验中心提供)10只，雌雄兼有，体重2.0～2.5kg，处死后立即摘出眼球共20个，随机取2个角膜片，用4%的多聚甲醛固定作为正常对照。剩下的18个角膜片随机分为3组，每组6个角膜片。按常规角膜中期保存方法，分别置于M-K液、M-K＋EGF液和Optisol保存液内4℃冰箱保存。每只角膜用保存液20ml。

　　1．3　末端转移酶介导的DNA缺口生物素-dUTP（TUNEL）原位标记

　　保存第3、5 、7天，每组各取2个角膜片，每个角膜片一半用4%多聚甲醛固定，与作为正常对照的2个角膜片一样，进行常规石蜡包埋切片。

　　组织切片按常规方法脱蜡、脱水，用0.5%的胃蛋白 酶(Sigma Chemical Company，U．S．A．），37℃下60m in，PBS轻洗2次；再加0.1%TritonX-100和0.1%枸盐酸钠液处理2 min，PBS轻洗2次；然后，每个标本加入5μl的TUNEL酶和45μl的TUNEL标记(Bo ehringer　Mannheim，Germany)的混合物，阴性对照组仅加入TUN EL标记，阳性对照组在加入TUNEL反应混合物之前，先用DNase Ⅰ（Sigma C hemical Company，U．S．A．）在室温下处理10min；最后将其置入37℃湿房中30min，再用PBS轻洗3次，加盖玻片。

　　用荧光显微镜，在同一放大倍率下，不同保存时间角膜，各随机取6个视野，进行TUNEL阳性细胞记数。

　　用F检验和q检验进行统计学处理。

　　1．4　透射电镜观察

　　分别 于保存第3、5、7天，每组各取2个角膜片，每个角膜片的另一半进行常规透射电镜观察。

　　1．5　M-K液和Optisol液保存人角膜的细胞凋亡检测

　　眼库常规M-K液和Optisol液保存第4天的人角膜各2个，每个角膜的一半，按上述的方法进行TUNEL原位标记，另一半进行透射电镜观察。

　　2　结果

　　2．1　角膜透明度及厚度

　　保存在M-K液、M-K＋EG F液和Optisol 保存液中3～7天的角膜均可见轻度水肿、增厚，但外观保持透明或半透明。

　　2．2　TUNEL标记法原位标记

　　所有阴性对照组均未见TUNEL阳性细胞；阳性对照组可见大量TUNEL阳性细胞。正常对照组有一个标本在较周边部的上皮细胞基底层可 见几个TUNEL阳性细胞。

　　M-K液、M-K＋EGF液和Optisol保存液保存 3、5、7天的角膜片，在上皮、基质及内皮细胞层均可见TUNEL阳性细胞。每种保存 液保存不同时间的角膜，其TUNEL阳性细胞计数见表1。用F检验和q检验进行统计学处理显示：(1)每种保存液保存的角膜，在不同保存时间，其TUNEL阳性细胞数比较，差异有显著性(P＜0.01)。在3～7天内，随着保存时间的延长，TUNEL阳性细胞 数明显增加。(2)M-K液和M-K＋EGF液保存相同时间的角膜，其TUNEL阳性细 胞数比较，差异没有显著性（P＞0.05）。而它们与Optisol保存液保存相同 时间的角膜比较，在保存3、5、7天不同时间点，TUNEL阳性细胞数比较，差异均有 显著性(P＜0.01)。

表1　保存角膜的TUNEL阳性细胞数（±s）

Tab．1　TUNEL-positive cells of s toraged corneas （±s）

　　2．3　透射电镜观察

　　透射电镜下3种保 存液保存3 、5、7天的角膜，在上皮、基质及内皮细胞层均可见典型的凋亡细胞。表现为细胞浆和细 胞核的浓缩、核的碎裂及凋亡小体形成。2．4　M-K液和Op tisol液保存人角膜的细胞凋亡检测

　　M-K液和Optisol液保存4天的人角膜，其上皮、基质及内皮细胞层均可见TUNEL阳性细胞(图1)；透射电镜下可见典型的凋 亡细胞(图2～4)。

1　Optisol液保存4天的人角膜，其上皮、基质及内皮细胞层均可见TUNEL阳性细胞（×50）

　　Fig．1　H uman corneas preserved in optisol liquid for 4 d．TUNEL-positive cells were observed in corneal epithelium，stroma，a nd endothelium （Magnification×50）

2　M-K液保存4天的人角膜，透射电镜下，角膜上皮基底层可见凋亡细胞（×10000）

　　Fig．2 Human corn eas preserved in M-K li quid for 4d．Apoptotic cells were observ ed in the basal layer of corneal epithel ium by transmission electron microscope （Magnification×10000）

　　图3 　M-K液保存4天的人角膜，透射电镜下，角膜上皮表层可见凋亡细胞(×10000）

　　Fig．3 Human corneas preserved in M-K liquid for 4d． Apoptotic cells were observed in the sur face layer of corneal epithelium by tran smission electron microscope （arrow）（Mag nification×10000）

4 　M-K液保存4天的人角膜，透射电镜下，角膜基质可见凋亡细胞（× 10000）

　　 Fig．4 Human corneas preserv ed in M-K liquid for 4d．Apoptotic cells were observed in corneal stroma by tran smission electron microscope （Magnificat ion×10000）

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