对象与方法

　　1. 研究对象：选择同一家系的2例RP患者（先证者及先证者之父）及经眼部检查无RP等其他眼部疾患的2例正常人（先证者的弟弟和长子）。先证者及先证者之父均于20岁或20岁前出现夜盲和视力下降症状，分别于1988年、1964年经眼底、视觉电生理、视野、眼底血管荧光造影及眼部常规检查确诊为RP（表1）。家族中先证者的姑姑和祖母有类似病史且已故。RP诊断标准：(1)有夜盲史；(2)眼底检查可见骨细胞样或不规则的色素沉着，视网膜血管缩窄和视盘颜色蜡黄或变淡；(3)全视野视网膜电图显示异常或无波形；（4）视野缩窄或有环形暗点等特征性改变和（或）适应曲线阈值升高或视网膜杆体相缺如。

　　2. RDS基因突变的研究方法：收集新鲜周围静脉血5ml, 以苯酚/氯仿法抽提DNA^［2］。聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）：采用美国Perkin Elmer 公司生产的480型DNA Thermal Cycler 仪。PCR试剂盒系德国Boeringer Mannheim公司产品。引物^［3,4］：primer 1、2（primer 1: 5′-AAGCCCATCTC-CAGCTGTCTG-3′覆盖RDS基因内含子1的3′末端，primer 2: 5′-CTTACCCTCTACCCCCAGCTG-3′覆盖RDS基因内含子2的5′末端）由中国科学院微生物研究所合成。PCR反应系统：10×Buffer 10 μl, 50 mol/L MgCl₂ 3　μl，2.5　mol/L dNTP 8　μl，primer 1、2各2.5　μl(10　pmol/μl), DNA模板3.5　μl(30　ng/μl)，Taq DNA聚合酶0.5 μl(5 U/μl)，加ddH₂O至100 μl。扩增条件：95℃ 5 min后加Taq DNA聚合酶，液体石蜡15 μl；变性94℃ 1　min，退火50℃ 2 min，延伸72℃ 3 min，共35个循环，再做72 ℃延伸6 min。PCR产物检测：扩增完毕，从100 μl PCR样品中取5μl样品在1.5% 琼脂糖凝胶上进行电泳（3 V/cm）检测，DNA分子量标记为华美生物工程公司的pGEM-3 Zf(+)/Hae Ⅲ DNA Marker(587 bp、458 bp、434 bp、323 bp、314 bp、289 bp、267 bp、174 bp、142 bp、102 bp、80 bp、18 bp、11 bp)。0.5 μg/ml溴乙啶染色15 min后，用透射式紫外线观察，摄像。

　　限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)分析：限制性内切酶DdeⅠ系美国Promega公司产品。反应系统：10×Buffer 3 μl, Dde Ⅰ 0.5 μl(6U)，PCR产物14 μl，加ddH₂O至30 μl。反应条件：37 ℃水浴1～2 h。取限制性内切酶消化后的样品15 μl在1.5 %琼脂糖凝胶上电泳(3 V/cm)，DNA分子量标记为pGEM-7Zf(+)/HaeⅢ DNA Markers (657 bp、458 bp、434 bp、328 bp、289 bp、267 bp、174 bp、142 bp、102 bp、80 bp、40 bp、18 bp、11 bp)。0.5 μg/ml溴乙啶染色15 min后，用透射式紫外线观察并摄像。

　　将上述PCR产物在低熔点琼脂糖凝胶上进行电泳并回收，加EcoR I adaptors接头及已连接接头的DNA末端磷酸化，去除未连接接头；制备克隆载体pUC18 DNA,用 EcoR I酶切并脱磷酸化，连接：pUC 18 DNA 2 μl，突变DNA 5 μl, 加ddH₂O至7.5 μl，45℃ 5 min, 冷却至0℃，加入10×T4 DNA 连接酶Buffer 1μl, T4 DNA接连酶0.l Weiss 单位，5 mmol/L ATP 1 μl, 16℃温育4h。制备感受态细胞，转化质粒DNA，筛重组子，提取质粒DNA，筛选及鉴定阳性克隆^［2］,经中国科学院微生物研究所基因工程中心测序。

　　3.眼部表型的检测方法：询问RDS基因突变患者的详细病史。绘制家系图，测视力、矫正视力，检查外眼，用裂隙灯显微镜检查眼前节，直接检眼镜检查玻璃体及眼底，进行闪光视网膜电图（flash electroretinogram, F-ERG）、Topcon 静态视野、Goldmann动态视野、眼底血管荧光造影（fundus fluorescein angiography, FFA）、眼底摄像、D-15色相配列试验及暗适应等眼部检查。

　　结果

　　1.RDS基因216密码子突变研究结果：本研究设计的引物primer 1位于人RDS基因内含子1的3′末端，引物primer 2则在内含子2的5′末端，用此对引物做PCR,扩增出RP患者和正常人RDS基因外显子2的DNA片段313 bp（图1）。正常人和无RDS基因216密码第887位点C→T颠换的RP患者，缺乏限制性内切酶DdeⅠ的酶切位点（DdeⅠ的识别序列为5′-C↓TNAG），其酶切产物长度仍为313 bp；如果出现杂合型基因第887位点C→T突变，则其酶切产物长度有3种，即313、215、98 bp(图2)。RDS基因外显子2的第216密码887位点C→T颠换，使216密码编码的脯氨酸(proline, Pro)突变为亮氨酸（leucine, Leu），即发生Pro216 Leu突变。经筛查来自同一家系的2例RP患者（先证者、先证者之父）有杂合型RDS基因Pro216Leu突变，而家系中的正常人则无此突变。经中国科学院微生物研究所基因工程中心测序证实为RDS基因单链Pro216 Leu（CCT→CTT）突变。

　　2. RDS基因Pro216 Leu突变与眼部表型的关联:详见表1及图3，4。

表1　有RDS基因Pro 216 Leu突变的RP患者眼部表型分析

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