【摘要】 目的：研究慢性高眼压大鼠视网膜水通道蛋白4(AQP4)表达的变化与视网膜损伤的关系。方法：通过电凝巩膜表层静脉的方法制成慢性高眼压模型。用免疫组化和RTPCR的方法观察AQP4在高眼压过程中不同时点的表达变化，同时观察在慢性高眼压过程中大鼠视网膜的形态学变化。结果：AQP4在正常和高眼压大鼠的视网膜皆有表达，表达的部位都位于节细胞层、内丛状层、内核层、外丛状层及外核层。在高眼压大鼠的视网膜上AQP4的表达随着高眼压时间的延长而增多。HE染色的组织切片上发现，与正常对照组相比高眼压大鼠视网膜的厚度有显著变化。结论：眼压升高后AQP4表达上调，与视网膜的厚度变化密切相关。
【关键词】 AQP4 视网膜 青光眼 损伤 节细胞
Expression of AQP4 in rat retina after chronic elevation of IOP
YingShuang Wang, DianWen Gao, Qian Sha, QingZhu Nie, DongMei Gui
Harbin Aier Eye Hospital, Harbin 150076, Heilongjiang Province, China; Department of Ophthalmology, Shengjing Hospital of China Medical University, Shenyang 110004, Liaoning Province, China
Abstract
AIM: To investigate the expression of AQP4 and the potential role of it in rat retina after chronic experimental elevation of IOP.
METHODS: Wistar rats (n=90) received unilateral episcleral veins coagulation to elevate IOP. Immunohistochemistry and RTPCR were used to detect the expression of AQP4. IOP elevation induced retina damage was evaluated histologically.
RESULTS: AQP4 expressed both in IOP elevation groups and the fellow one. It was located in GCL, IPL, INL, OPL and ONL, there was no disparity in disposition among different groups. However, the expression of AQP4 increased in IOP elevation retina with the time going on. On HE staining tissue slices, the thickness of IOP elevation retina changed significantly versus the control one, thickening at the first stage and thinning at last during the period of IOP elevation.
CONCLUSION: The expression of AQP4 is upregulated and intimately correlate with the thickness of the retina after the IOP being elevated, this suggests that AQP4 may involve in damage of IOP elevation retina. The function and feature of AQP4 indicates that it may participate in the damage by several mechanisms.
KEYWORDS: AQP4; glaucoma; retina; damage; ganglion cell
0引言
水通道蛋白即存在于动植物及微生物细胞膜上转运水的特异孔道,该孔道由一系列具有同源性的内在膜蛋白家族成员形成,它们介导着不同类型细胞膜的跨膜水转运。1988年Agre等[1]对红细胞膜分离纯化多肽时发现一28kDa的疏水性跨膜蛋白,称为形成通道的整合膜蛋白28(channel forming integral membrane protein, CHIP 28)。目前已从哺乳动物的组织中鉴定出13种水通道蛋白aquaporin(AQP)，其中AQP4在眼中的分布与青光眼的发病机制有密切关系[2,3]。AQP4存在于睫状体、小梁网和Schlemm管。AQP4也存在于中枢神经系统和视网膜相同类型的细胞上[4]。在脑的缺血和缺血再灌注损伤的研究中发现AQP4在缺血缺氧和再灌注后的脑组织中的表达上调且通过基因干扰的方法使AQP4的表达增加时脑组织的损伤明显加重[5,6]。Verkman发现，在大鼠眼球的缺血再灌注模型中，AQP4基因缺失鼠视网膜各层的水肿较野生型鼠明显减轻。我们通过阻断大鼠巩膜浅层静脉的方法阻断房水的外引流途径[7]，使其眼压升高，模拟慢性青光眼的发病过程，并研究这一过程中，视网膜AQP４表达的变化，分析其表达和视网膜变化的关系，探讨AQP４在青光眼损伤过程中可能的机制和作用，为青光眼的治疗提供新思路。
1材料和方法
1.1材料 健康、雄性、体质量200～300g的Wistar大鼠90只，由中国医科大学实验动物部提供。随机分为对照组15只（30眼）和高眼压组75只（150眼）。Rabbitanti—AQP4（武汉博士德公司），SABC试剂盒（武汉博士德公司），RNAout（武汉博士德生物制剂公司），MMLV逆转录酶（美国Promega公司产品），耐热性Taq DNA聚合酶（大连宝生物工程公司），100bp DNA ladder（华美生物工程公司），TaKaRa RNA PCR kit（TaKaRa公司）PCR引物：依照GeneBank标准 primer Express 3软件设计。内参GAPDH引物序列：sense 5ACCACAGTCCATGCCATCAC3，antisense 5TCCACCACCCTGTTGCTGTA3，PCR产物大小为452bp；目的基因AQP4引物序列：sense 5TTGGACCAATCATAGGCGC3， antisense 5CGGTCAATGTCGATCACATGC3，PCR产物大小为213bp。
1.2方法
1.2.1建模 100g/L水合氯醛0.3mL/g ip麻醉以tonopen笔式眼压计测量双眼压，3次/眼，平均值在9～16mmHg者进入实验。实验组大鼠眼球沿角膜缘剪开球结膜270°，暴露并分离鼻侧上方两支巩膜浅层静脉予以电凝使近角膜缘血管充血扩张，远角膜缘血管消失。术后3d每日典必舒眼药水点眼、眼膏涂眼。对照组除未电凝巩膜浅层静脉外，其余步骤皆相同。分别于术后0.5h；3，7，14，21和28d测量眼压获取标本。取平均值超过术前40%者进入实验。
1.2.2 RTPCR 剪碎视网膜提取总RNA，取少量RNA溶液用于紫外分光光度计进行RNA纯度和含量测定，将浓度达到IA260/IA280比值在1.8～2.0之间的样本用于逆转录反应。逆转录反应的反应条件为42℃ 30min，99℃ 5min，5℃ 5min。PCR扩增反应条件为95℃ 5min，94℃ 30s, 55℃ 30s, 72℃ 40s，共32 个循环，72℃ 10min。PCR扩增反应的引物序列为,内参(GAPDH)：sense 5ACCACAGTCCATGCCATCAC3，antisense 5TCCACCACCCTGTTGCTGTA3，PCR产物大小为452bp；目的基因(AQP4)：sense 5TTGGACCAATCATAGGCGC3，antisense 5CGGTCAATGTCGATCACATGC3，PCR产物大小为213bp；PCR产物进行12g/L的琼脂糖凝胶（含0.5g/L溴乙啶）电泳，恒定电压100mV,时间45min，然后进行自动紫外电泳凝胶扫描仪扫描,测量结果以吸光度比（IDV）表示。
1.2.3免疫组化及HE染色 按试剂盒说明进行操作。HE染色不需抗原修复，盐酸乙醇分化后伊红染色。各组取距视神经鼻侧200μm的视网膜切片进行Olympus/BX51/Evolution MP 5.0摄像采集图像，MetaMorph显微图像分析系统分析，测量结果以阳性细胞的积分吸光度（IA）表示。
统计学处理：数据经SPSS 13.0统计软件分析，统计结果均以±s表示，行OneWay ANOVA检验，Turky多重比较及Pearson 相关分析。
2结果
2.1 AQP4基因表达 AQP4基因在正常视网膜中有表达,高眼压7d表达明显上升,之后虽有所下降，但仍维持在较高水平。Levene方差齐性检验，P=0.071(P>0.05)方差齐; OneWay ANOVA分析P<0.01,故认为AQP4 mRNA在6组中的表达至少有1组与另外1组差异显著;组间多重比较检验(Turky法)表明除高眼压3d组外，各实验组与对照组的差异有统计学意义（图1）。
2.2 AQP4蛋白表达 细胞膜上出现棕黄色颗粒的细胞为免疫阳性细胞。AQP4广泛分布于正常及高眼压视网膜的神经节细胞层，内丛状层、内核层和外丛状层、在外核层也有少量存在。高眼压7d表达明显上升,之后虽有所下降，但仍维持在较高水平。Levene方差齐性检验，P=0.125(P>0.05)方差齐; OneWay ANOVA分析P<0.01,故认为AQP4在6组中的表达至少有1组与另外1组差异显著；组间多重比较检验(Turky法)表明除高眼压3d组外，各实验组与对照组的差异有统计学意义（图2）。
图1 AQP4 mRNA在视网膜的表达 M：Marker；1：对照；2～6：高眼压3，7，14，21，28d（略）
2.3视网膜厚度变化 高眼压7d视网膜明显增厚,节细胞水肿，胞质空亮，内层视网膜间隙增大，14d仍比正常对照组增厚，高眼压21d以后逐渐萎缩，可见到部分节细胞核变小深染。Levene方差齐性检验，P=0.311(P>0.05)方差齐; OneWay ANOVA分析P<0.01,故认为AQP4 mRNA在6组中的表达至少有1组与另外1组差异显著；组间多重比较检验(Turky法)表明除高眼压3d组外，各实验组与对照组的差异有统计学意义（图3）。
2.4 AQP4表达与视网膜厚度相关 Pearson correlation analysis结果为：r=0.578，P=0.02因此认为高眼压后AQP4表达的多少与视网膜厚度变化有相关关系，P＜0.05表明二者之间的相关关系有统计学意义。
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