【摘要】 目的：拟通过对于视神经损伤后轴突的病理变化和GFAP及星形胶质细胞分泌的ECM阻抑性大分子CSPG的表达分布情况，观察视神经损伤后的修复反应，为进一步研究中枢神经纤维的再生提供实验资料。方法：首先建立大鼠视神经不完全损伤的挤压伤模型，于损伤后不同时间段取材进行HE染色和GFAP及CSPG的免疫组织化学研究。结果：HE染色示大鼠视神经损伤后3～7d小胶质细胞增殖吞噬功能活跃，伤后14d，损伤处可见多处新生血管。免疫组织化学结果示大鼠视神经损伤后7d，GFAP在损伤区缺乏表达，而CSPG在损伤区中心呈强阳性表达。结论：CNS轴突再生失败可能与损伤局部瘢痕形成的机械性阻碍和CSPG沉积的化学性阻碍有关。
【关键词】 视神经损伤 CSPG GFAP 免疫组化
Pathological and histochemical research of optic nerve injury in rats
Li Shan, ShuiHua Zhang, BinBin Yang
Foundation items: Natural Science Foundation of Heilongjiang Province(No.D200517);Doctoral Startup Foundation of the Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University(No.BS200501)
Department of Ophthalmology, the Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150086,Heilongjiang Province,China
Abstract
AIM: To investigate the pathological changes of axon and the expression of ECM inhibiting chondroitin sulfate proteoglycan (CSPG) secrected by astrocytes after optic nerve injury, and to observe the repairing response of axon after injury so as to provide the experimental data for further research on regeneration of central nervous fiber.
METHODS: Firstly, rat model was induced by means of incompletely crush wound of optic nerve using across action forceps behind eyeball. Then, we observed the injury of axon by HE and immunohistochemistry of GFAP and CSPG.
RESULTS: HE indicated that microglial cells increased and its phagocytic function became active 3 to 7 days after injury. And neovascularization was observed after 14 days. The results of immunohistochemistry showed that the expression of GFAP was low at injured area, but CSPG presented a strong positive expression at the center of injured area 7 days after injury.
CONCLUSION: The poor regeneration of optic nerve is partially related with neovascularization and CSPG deposit of injury site.
KEYWORDS: optic nerve/crush wound; chondroitin sulfate proteoglycan; glial fibrillary acidic protein; immunohistochemistry
0引言
视神经损伤有一半左右的病例最终丧失视力，了解视神经轴突对损伤的潜在反应，对于帮助神经再生和修复是非常必要的。我们首先建立视神经损伤的动物模型，观察其组织病理和轴突损伤情况。为了进一步明确星形胶质细胞的增生状况，我们观察其标记抗体胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）的表达，以及星形胶质细胞分泌的细胞外基质（extracellular matrix,ECM）阻抑性成分硫酸软骨素蛋白多糖（chondroitin sulfate proteoglycan,CSPG）的表达分布情况。
1材料和方法
1.1材料 实验动物模型和分组40只SD大鼠用于本实验，100g/L水合氯醛腹腔注射麻醉（35mg/kg）后，眼部置于显微镜下，剪开球结膜约5mm，分离结膜下组织，向后分离，打开肌锥，暴露视神经，用压力恒定的反向镊于球后2mm处夹持视神经，随即观察大鼠眼底血液供应情况，避免损伤眼动脉。夹持时间5s，松开反向镊后缝合球结膜。再次观察眼底供血情况，确认无缺血者，纳入实验。正常对照组为假手术眼，只暴露视神经，不夹持。用于HE染色的大鼠分为损伤后1，3，7，14，28d及对照组（n=4）；用于GFAP和CSPG免疫组织化学的大鼠，分为损伤后7，14，28d及对照组（n=4）。动物灌注与取材：100g/L水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰卧固定开胸，暴露心脏。将吸有0.01mol/L的PBS的针头刺入左心室，剖开右心室排液。缓慢持续将PBS灌入心脏，待多数血液流出去后换用40g/L的多聚甲醛缓慢灌注，至大鼠四肢及尾部出现肌束颤动，取长约5～6mm的球后视神经常规石蜡包埋，纵行切片。兔抗人GFAP多克隆抗体，SP二抗试剂盒（北京中山公司）；小鼠抗大鼠CSPG单克隆抗体（Sigma 公司）免疫组织化学SP法染色（按试剂盒说明）：石蜡切片，常规脱蜡至水，0.01mol/L PBS(pH7.4)中漂洗，3mL/L H2O2室温下孵育20min，0.01mol/L PBS漂洗，血清封闭30min，吸取封闭血清，加入适量按一定比例稀释的一抗，于湿盒中4℃孵育过夜，PBS中漂洗，加入生物素二抗IgG，37℃孵育30min，PBS漂洗，加入辣根过氧化物酶标记的链酶亲和素（即SP复合物），室温下孵育30min，PBS中漂洗后DAB显色，在显微镜下观察颜色变化，适度后终止显色。阴性对照在应加一抗时只加PBS。
图1 视神经损伤后的组织形态和病理变化 A：1wk损伤区及附近胶质细胞增生，偶见新生血管（HE×10）；B：1wk泡沫样反应的小胶质细胞和新生血管（HE×40）；C:2wk可见多处新生血管(HE×40);D:4wk损伤处细胞接近正常，网状纤维增多(HE×10)（略）
图2 视神经损伤后1wk的免疫组化结果(IHC×40) A:CSPG在损伤中心(箭头所示)的强阳性表达;B:GFAP阳性表达在损伤边缘区略高，损伤区没有表达（略）
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