【摘要】 检测孔源性视网膜脱离行玻璃体切割术后视网膜前膜中fibronectin，Ⅰ，Ⅲ型胶原表达。方法：采集孔源性视网膜脱离玻璃体切割术后因PVR再次行剥膜术的所有视网膜前膜标本35例，分黄斑前膜组与周边前膜组。用免疫组织化学方法检测35例视网膜前膜中fibronectin，Ⅰ，Ⅲ型胶原的阳性表达。将两组间3个指标阳性率进行统计学分析。结果：黄斑前膜组中Ⅰ、Ⅲ型胶原阳性表达均为14例（93%），12例FN阳性表达（80%）。周边前膜组中，19例Ⅰ型胶原阳性表达（95%），7例Ⅲ型胶原阳性表达（35%），17例FN阳性表达（85%）。两组比较，Ⅲ型胶原阳性表达有显著性差异（P<0.01）。结论：孔源性视网膜脱离PPV术后视网膜前膜中含Ⅰ，Ⅲ型胶原和FN，可能在玻璃体切割术后视网膜再次脱离过程中起作用。
【关键词】 孔源性视网膜脱离 玻璃体切割术 增殖性玻璃体视网膜病变 视网膜前 疫组织化学
0引言
随着技术的进步，玻璃体切割术已被广泛用于治疗复杂性视网膜脱离，其手术治愈率有了很大的提高，但仍有部分患者因为复发视网膜脱离而需再次采用玻璃体手术。增殖的视网膜前膜导致视网膜皱襞形成是术后视网膜脱离复发最主要的原因[1]。目前，对于孔源性视网膜脱离玻璃体切割术后复发性PVR中视网膜前膜的研究很少。一些学者[24]通过回顾性研究分析临床资料的方法对这种视网膜前膜的发生机制作了一些探讨。本研究采用免疫组织化学的方法，检测了玻璃体切割术后PVR的视网膜前膜中fibronectin、Ⅰ、Ⅲ型胶原的阳性表达，初步探讨了这种视网膜前膜的发病机制。
1材料和方法
1.1材料
200211/200406孔源性视网膜脱离玻璃体切割术后复发性PVR需行第2次玻璃体视网膜手术者共35例35眼，合并视网膜脱离者17例17眼。包括黄斑前膜者15例，周边前膜者20例。两次玻璃体手术时增殖性玻璃体视网膜病变程度根据1983年美国视网膜学会命名委员会所定标准。第1次玻璃体手术PVR分级A～C227例，其中A级8例，B级8例，C1级7例，C2级4例；C3级或以上8例，其中C3级5例，D1级3例。第2次玻璃体手术时PVR分级：B～C27例，其中B级1例，C1级4例，C2级2例；C3级或以上28例，其中C3级11例，D1～D317例。玻璃体视网膜手术采用美国STORZ公司生产的玻璃体切割机施行，手术采用标准三切口经巩膜扁平部玻璃体切割术切口，术中用视网膜镊及自制视网膜钩剥除紧贴着视网膜的前膜。剥除的视网膜前膜经1mL注射器针头迅速过渡到装有40g/L中性多聚甲醛的 Eppendorf管中，放入4℃冰箱，24～48h内石蜡包埋备用。胰酶（Sigma公司），小鼠抗人collagen ⅠmAb，小鼠抗人collagen ⅢmAb及小鼠抗人FN mAb（BD公司），羊抗小鼠IgGCy3及羊抗小鼠IgG FITC（Sigma公司）；荧光倒置显微镜（Zeiss Axiovert200型），光学显微镜（Nikon YS100型）。
1.2方法
取出视网膜前膜标本，常规酒精、二甲苯脱水透明；56℃以下低熔点石蜡中浸蜡4h及常规石蜡包埋；连续石蜡切片，厚度4μm；贴片，37℃烤箱中干燥后置4℃冰箱中保存备用；每个标本各取一张石蜡切片进行常规HE染色，光学显微镜下观察、照相。取石蜡切片置二甲苯中脱蜡20min，梯度酒精复水；PBS缓冲液冲洗3次，每次3min；50g/L BSA/PBS200μL，室温下作用1h（或4℃冰箱过夜）；PBS缓冲液冲洗3次，每次3min；滴加1.25g/L胰酶100μL，37℃作用15min；PBS缓冲液冲洗3次，每次3min；加入1∶100的第一抗体100μL（小鼠抗人collagenⅠ，ⅢmAb或小鼠抗人FN mAb），37℃作用1h（用PBS代替一抗设阴性对照片）；PBS缓冲液冲洗3次，每次3min；加入1∶100的Cy3或FITC标记的第二抗体50μL，37℃避光作用30min；PBS缓冲液冲洗3次，每次3min，用蒸馏水冲洗1min，500mL/L甘油PBS封片；荧光显微镜观察、照相。出现明亮红色或绿色荧光，其染色强度明显高于背景非特异染色者为该部位Ⅰ，Ⅲ型胶原或FN荧光染色阳性。
统计学处理：数据用SPSS11.5统计软件包进行统计，采用Fisher确切概率法，P<0.05为统计学上有显著性差异。
2结果
在光学显微镜下，两组的病变中均可见大量的平行、交叉、网状排列的胶原纤维，前膜中含有成纤维细胞、淋巴细胞和少数色素上皮样细胞，未见有新生血管（图1AC）。
2.1Ⅰ型胶原
在荧光显微镜下，可见大量线状、网状、团状的明亮红色荧光弥散分布。35例前膜中33例可检测到Ⅰ型胶原（33/35，94%）。黄斑前膜组Ⅰ型胶原阳性表达为14例（14/15，93%）（图2A），周边前膜组中Ⅰ型胶原阳性表达19例（19/20，95%）（图2B）。以PBS代替一抗的阴性对照片呈阴性（图2C）。两组比较，采用Fisher确切概率法进行统计，P=0.681>0.05，无显著性差异。
2.2 Ⅲ型胶原
在荧光显微镜下，可见大量线状、网状、团状的明亮红色荧光弥散分布。35例中21例检测到Ⅲ型胶原（21/35，60%）。黄斑前膜组Ⅲ型胶原阳性表达为14例（14/15，93%）（图3A），周边前膜组中Ⅲ型胶原阳性表达7例（7/20，15%）（图3B），以PBS代替一抗的阴性对照片呈阴性（图3C）。两组比较，采用Fisher确切概率法进行统计，P<0.01，有显著性差异。
2.3纤维粘连蛋白
在荧光显微镜下，可见线状、网状、团状的明亮绿色荧光弥散分布。35例中有29例FN阳性(29/35,83%)。黄斑前膜组FN阳性表达12例（12/20，80%）（图4A）；周边前膜组中FN阳性表达17例（17/20，83%）（图4B）。以PBS代替一抗的阴性对照片呈阴性（图4C）。两组比较，采用Fisher确切概率法进行统计，P=0.519>0.05，无显著性差异。
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