21世纪是生命科学的世纪，也是一个信息爆炸的时代。 2002年6月26日首张人类基因图和测序计划(HGP)完成后；科学家们开始进入功能基因组即“后基因时代”的研究。随蛋白组学研究与疾病相关基因和功能蛋白不断发现，出现了大量的生物信息和需要解决的医学问题。随之，现代生物技术转入基因组学技术、蛋白组学技术、生物信息学、生物芯片技术、基因克隆、重组、表达技术，动物体细胞克隆技术等方面，其中引人关注的是生物芯片技术。生物芯片技术始于20世纪80年代后期，被评为1998年度世界十大科技进展之一，其概念源于计算机芯片，其成熟标志为全球掀起至今方兴未艾的技术研究和产业化生产的热潮。

　　1  基因芯片技术概念和基础知识

　　生物芯片(biochip)是指包被在固相载体如硅片、玻璃、塑料和尼龙膜上的DNA微阵列、寡核苷酸微阵列和蛋白质微阵列，通过微加工和微电子技术在固体芯片表面构件的微型生物分析系统，以实现对组织、细胞、蛋白质、核酸及其他生物组分的准确快速、大信息量检测分析。特点是高通量、微型化和自动化。生物芯片根据性能不同分为两大类6种。即信息芯片和功能芯片，其中信息芯片根据芯片载体材料的不同分为基因芯片、蛋白芯片、细胞芯片和组织芯片；功能芯片根据结构和功能特点分为微流体芯片和芯片实验室。

　　将大量基因片段或寡核苷酸有序地、高密度地 (点与点间距一般＜500μm) 排列在玻璃、硅等载体上, 称之为基因芯片（gene chip）。由于该技术可将大量DNA、RNA、抗体、酶、蛋白等生物分子作为探针固定于塑料、玻璃等支持物表面, 且每一种分子或几种分子探针代表一种病原体或疾病 （如各种肿瘤、自身免疫性疾病、内分泌疾病 ),从而解决了快速、微量、准确地诊断疾病、了解病情的要求［1,2］ 。基因芯片技术的基本原理是分子杂交。 基因芯片技术的基本流程：首先从拟研究对象的组织或细胞中提取RNA，逆转录成cDNA，同时进行标记，或进一步制备cRNA并标记。这些标记过的cDNA或cRNA称为靶基因(target)。然后与固定在玻璃片上或尼龙膜上或硅片上的高度密集、排列有序的探针杂交。最后扫描并定量检测杂交信号的强弱。

　　根据不同的用途，目前开发应用的基因芯片总体上可分为两种类型［3， 4］ ：用于 DNA序列分析的基因芯片和用于基因表达分析的芯片。另外，目前出现“微缩实验室芯片” (lab-on-a-chip)包括生物样品制备芯片、 PCR芯片、毛细管电泳芯片等，可将相应烦琐的分子生物学试验过程集中于一块或几块片基上完成。

　　基因芯片技术类似于 Southern 和 Northern 印迹杂交技术，通过探针与固定于芯片上的大量 cDNA 表达序列标签 (EST) 或寡核苷酸的杂交来实现［2］ , 只是许多探针 （可以是同种分子或不同种分子）同时固定在同一芯片上, 在相同的实验条件下, 同时完成多种不同分子的检测［2，5～7］ 。即先在芯片上按照特定排列方式固定大量的靶基因, 形成一种微阵列, 然后将样品 DNA/RNA 通过多聚酶链反应 / 逆转录多聚酶链反应 (PCR/RT-PCR) 扩增、体外反转录等技术掺入荧光标记分子后, 与位于芯片上的靶基因杂交, 最后通过荧光扫描仪及计算机综合分析后即可获得样品中大量基因序列及表达的信息。基因芯片分为模式Ⅰ和模式Ⅱ2种。模式Ⅰ是指将靶 DNA 固定于支持物上, 适合于大量不同靶 DNA 的分析; 模式Ⅱ是将大量探针分子固定于支持物上, 适合于对同一靶 DNA 进行不同探针序列的分析。其具有稳定、点密度较高、探针分子对疾病的针对性强等特点［8,9］ 。

　　基因芯片制备的方法主要有原位合成与合成点样。原位合成又分为光引导聚合法和喷墨打印合成法（压电打印法)。光引导聚合法在合成前需先对介质进行处理, 使之衍生出羟基或氨基并与光敏保护基建立共价连接, 合成单体的一端用固相合成法化, 另一端与光敏保护基相连。在合成反应过程中, 通过蔽光膜使特定的位点透光, 其余点不透光, 只有受光的位点才能脱掉保护基并与特定单体活化端相连, 单体的光敏保护端露出, 经过若干上述循环反应后, 使每个位点按需要合成特定序列的探针, 其中每次合成反应中哪些位点上连接哪种单体, 由更换不同的蔽光膜来控制［10］ 。喷墨打印合成法是通过 4 个喷印头将 4 种碱基按序列要求依次喷印在芯片的特定位点上。合成点样法是指将预先合成好的探针用点样机点到介质上, 点样前需将介质表面包被氨基硅烷或多聚赖氨酸, 使之带上正电荷来吸附核酸分子。除上述 3 种方法外, 还有用聚丙烯酰凝胶作为支持介质, 将胶块 (40μm×40μm×20μm间隔80μm或100μm×100μm×20μm间隔200μm) 固定在玻璃上, 然后将合成好的不同探针分别加到不同的胶块上, 制成以凝胶块为阵点的芯片［11］ , 或者也可以通过导电的吡咯单体的聚合形成微阵列。其基本原理是:在硅片上镀一层 500nm 厚的金层, 通过蚀刻技术在硅片上形成金微电极, 吡咯单体经过聚合在微电极上形成一层聚吡咯膜, 其中与吡咯单体相连的探针在吡咯的聚合过程中连到电极上, 每种探针的位置通过特定电极的开启与关闭来控制［12,13］ 。 Ferguson 等［14］ 还利用光纤束建立了光纤生物传感微阵列, 它是将每根光纤维（直径200μm) 的一端共价连接上寡核苷酸探针, 然后将这些连有不同寡核苷酸探针的光纤维装配成光纤束, 构成光纤微阵列。检测时只需将光纤束连有不同探针的一端直接浸入靶样品溶液中即可, 产生的荧光杂交信号可通过光纤维传导至光纤束的另一端, 并通过荧光显微电荷偶联摄影系统对传导过来的信号进行检测。

　　基因芯片与传统的杂交法相比具有操作简单、快速、高效、自动化程度高、检测靶分子种类多、高度并行性、高度敏感性、成本低、结果客观性强等优点。自发展伊始已广泛应用于生命科学的各个领域，并已用于基因功能各方面的研究。 目前基因芯片技术主要应用于以下方面：(1)基因序列检测；(2)表达分析,是目前研究的热点；(3)突变和多态性检测［15］ ；(4)寻找新基因；（5）基因文库图谱绘制；（6）基因诊断［16］ ；（7）后基因组研究；（8）其他：包括药物筛选、耐药菌株和药敏检测［17］ 、药物作用机制、毒理学、环境化学等方面。

　　2  基因芯片技术在视网膜疾病研究中的应用前景

　　鉴于商品化的芯片中眼或视网膜特异基因相对较少。Farjo［18］ 等最早开始研发眼／视网膜特异芯片。他们分别从15.5天的CD-l小鼠胚胎组织、出生后2天的CD-1小鼠眼球及成年C57BL／6小鼠视网膜组织中分离RNA，构建cDNA文库。每一个文库均得到了大约2500条cDNA或EST。从中挑选出3188条进行测序。DNA序列分析证实其中的1952条与已知的cDNA或EST片段顺序相同。其余886条未找到同源顺序，可能代表新的cDNA或EST片段。以这些cDNA作为模板，PCR扩增后点在载玻片上，制备出了含大约2000个基因的眼／视网膜芯片。 Chowers I［19］ 等成功构建了人视网膜 cDNA库，包括 10034个序列。尚有 186个视网膜富集基因不知其在视网膜的功能，其中 96个为新基因。

　　Li［20］ 等为了探讨视黄酸(RA)诱导的视锥细胞抑素的基因调节通路，在培养的Weri-Rb1视网膜母细胞瘤的细胞中，一组加人视黄酸，另一组不加人视黄酸做对照。用含有6800种基因的DNA微阵列分析，结果表明视黄酸能诱导视锥细胞特有的基因表达上调；视杆细胞特有的基因表达下调。RA处理能使处于G0或G1期的细胞停止发育，增加人视锥细胞(hCAR)免疫活性和凋亡细胞的数量，下调细胞周期蛋白(细胞周期蛋白-E和细胞周期蛋白D3)和细胞周期蛋白依赖性致活酶(CDK5，CDK10)等关键基因的表达。 Lenzner［21］ 等比较Ndp敲除的鼠与野生型鼠基因表达，结果表明，在Ndp敲除的鼠基因转录缺乏或基因转录下调是光感受器细胞所特有的。而在年轻的(1岁内)Ndp敲除的鼠所有的这些转录呈现正常水平表达。Yoshidan等［22］ 将含有2400种人基因的微阵列载玻片与生物素或二硝基酚(DNP)标记的靶cDNA与从人视网膜提取的总RNA进行杂交，结果表明在含有2400种基因的载玻片中，多于50％基因与视网膜cDNA发生杂交。这些表达的大多数基因不随年龄而改变。发生基因差异表达的基因有24种，这些基因分为4组：司能量代谢、应激反应、细胞生长和神经或信号传递。得出的结论是，人视网膜老化与基因表达模式的改变有关，与应激反应和能量代谢有关的通路在视网膜老化过程中起着关键的作用。

　　Singh等［23］ 将从损伤的人视网膜色素上皮提取的ARPE-19细胞作为实验组，未损伤组作为对照组。在损伤修复的增殖期，从对照组和损伤组提取总RNA。合成32PdATP标记的cDNA探针并且与包含588种cDNA的Atlas微阵列进行杂交。结果显示损伤细胞的基因编码DNA合成和DNA修复蛋白上调表达比对照组高出6倍。他们认为RPE可能较早地参与了增殖性玻璃体视网膜病变的炎症反应。Wistow等［24］ 用人视网膜和脉络膜创建的cDNA文库，得出的结果是，最丰富的转录来源于11号染色体BBS1区域。大量首选转录的组织与视网膜、脉络膜和虹膜组织相似。

　　Buraczynska等［25］ 从人视网膜色素上皮分离的RNA创建两种cDNA文库(一种扩增，另一种不扩增)，从两种文库中随机选取克隆产物获得 5’末端序列。在这些序列中，多于2000种(EST)与公共数据库中的序列和基因族相似。EST证实了已知的RPE表达基因和500多种在其他组织中表达但不知道在RPE中表达的基因。甲状腺运载蛋白和90Kda热休克蛋白在这些文库中转录最多。证实了200多种新的EST和推测的蛋白。Joussen AM等［26］ 使用链脲霉素制成Long-Evans鼠模型，高密度cDNA阵列分析视网膜的基因表达。给药后第 3、 7、 21天基因表达上调超过 2倍的分别有 27、 60、 12个；没有基因表达下调超过 2倍的，通过对表达改变的基因及其编码蛋白的分析， 显示视网膜对糖尿病的反应包含有炎症成分，而且许多调节活性发生在糖尿病的第1周。

[1] [2] 下一页