华中科技大学同济医学院附属协和医院眼科 武汉， 430022
    张明昌  黄渝侃  王勇

   【摘要】 目的：探讨针对细胞周期性激酶抑制剂p27Kip1的小发夹RNA(shRNA)表达质粒对牛角膜内皮细胞增殖能力的影响。

    方法：设计有发夹状结构的三条p27Kip1-shRNA对应模板DNA序列，并构建无关序列HK-shRNA作为阴性对照。构建并鉴定重组质粒Pgenesil-P1、Pgenesil-P2，Pgenesil-P3和Pgenesil-HK。以脂质体法将4种重组质粒分别导入牛角膜内皮细胞。稳定转染后RT-PCR法和Western blot法检测牛角膜内皮细胞内p27Kip1 mRNA及蛋白水平，筛选出抑制效果最好的阳性siRNA质粒。用MTT法检测该质粒组及对照组细胞生长情况。流式细胞术检测各组细胞周期的分布。

    结果：酶切及测序证实4个重组质粒均构建成功。与空白对照组比较，Pgenesil-P1、Pgenesil-P2，Pgenesil-P3各组mRNA抑制效率分别为32.71%、67.76%和80.28%，蛋白表达水平降低了29.27%、64.73%和76.13%，以Pgenesil-P3抑制效果最明显（以上均P<0.01）。空白对照组与Pgenesil-HK蛋白和mRNA水平均无显著性差异（P>0.05）。与空白对照及阴性siRNA相比，Pgenesil-P3组牛角膜内皮细胞生长增快，增殖能力增强，G1期细胞比例下降，S期比例增加。

    结论：针对细胞周期性激酶抑制剂p27Kip1的shRNA可有效降低其的表达水平，并可使牛角膜内皮细胞增殖能力提高。RNA干扰介导的p27Kip1基因沉默可能是促进角膜内皮细胞再生的有效手段。

   【关键词】  RNA干扰；p27Kip1；质粒；角膜内皮细胞

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