2结果

    兔角膜基质细胞消化后1~ 2h贴壁，细胞伸展呈梭形，胞浆清亮，核居中。3~ 5d细胞形成密集单层，排列非常整齐，呈漩涡状。细胞免疫组化结果：波形丝蛋白染色阳性（图1），角蛋白染色阴性，证明细胞无上皮细胞的污染，是单一的角膜基质细胞。组织学观察：兔角膜基质细胞伸展呈梭形，在去细胞猪角膜基质材料表面紧密帖附（图2A）。扫描电镜观察：兔角膜基质细胞呈多角形伸展于去细胞猪角膜基质材料的表面，细胞和材料黏附紧密（图2B）。可见去细胞猪角膜基质材料上附着呈红色荧光的兔角膜基质细胞（图2C）

    图1 体外培养兔角膜基质细胞波形丝蛋白染色阳性

    3讨论

    组织工程角膜基质构建成功的关键是应用理想的载体作为细胞外基质来种植角膜基质细胞，形成近似体内的正常结构。这种载体应支持细胞生长，促进细胞融合，具有良好的组织相容性。猪角膜基质与人角膜基质结构相似，有完整的细胞外基质、基底膜、前弹力层和基质，存在多种生长因子，可诱导调节细胞的生长、繁殖、分化、增生。有研究发现角膜基质免疫原性很低，在细胞免疫方面，角膜基质仅占1.62%[3]。Li等[4]研究发现角膜基质和角膜缘上皮、角膜成纤维细胞间存在细胞因子调控网络。Friend等[5]、吴静等[6]分别在猪角膜基质上培养出角膜上皮细胞，使其在体外形成近乎生理状态下的角膜上皮组织。Amano等[7]在猪角膜基质上培养人角膜内皮细胞并移植成功。我们发现去细胞猪角膜基质材料具有三维空间网格状结构，良好的生物相容性[8]，而且有较好的治疗效果。以它为支架接种、培养兔角膜基质细胞构建出含细胞的组织工程角膜，经扫描电镜证实含细胞的组织工程角膜具有三维空间网格状结构，与正常角膜基质结构相近，可提供给角膜基质细胞充足的养份和物质交换空间，利于细胞生长、增殖和分化。角膜基质细胞在去细胞猪角膜基质材料上贴附生长良好。荧光显微镜观察可见去细胞猪角膜基质材料上附着呈红色荧光的兔角膜基质细胞，进一步说明了含细胞的组织工程角膜基质内含有的角膜基质细胞具有活性。因此，本实验在体外成功构建了含有活细胞的组织工程角膜基质。

【参考文献】
  1 Vacanti CA, Vacanti JP. Bone and Cartilagere construction with tissue engineering approaches. Otolaryngol Clin North Am ,1994;27(1):263-276

2陈冬红,袁南荣.实验性全厚板层角膜移植术的免疫组织学研究.眼科新进展,1999;19:169-171

3王智崇,葛坚,徐锦堂,陈家祺.角膜不同组织免疫原性分析.中华眼科杂志,2002;8(9):535-538

4 Li DQ, Tseng SC. Three patterns of cytokine expression potentially involved in epithelial -fibroblast interactions of human ocular surface. J Cell Physiol ,1995;163(1):61-79

5 Friend J, Kinoshita S, Thoft RA, Eliason JA. Corneal epithelial cell cultures on stromal carriers. Invest Ophthalmol Vis Sci ,1982;23(1): 41—49

6吴静,徐锦堂,赵松滨.培养角膜上皮移植的实验研究.中国实用眼科杂志,2001;19(3):178-179

7 Amano S. Transplantation of cultured human corneal endothelial cells. Cornea ,2003;22(7):66-74

8张超,金岩,胡丹,聂鑫,刘源,雷娟.异种脱细胞角膜材料的生物相容性研究.国际眼科杂志,2005;5(2):250-253

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