作者：柏丽娜 张学东    作者单位：重庆医科大学附属第一医院 眼科，重庆 400016

    【摘要】  目的 分析重庆地区汉族人群脂联素基因SNP +276 G/T的基因型分布，探讨该多态性与糖尿病性视网膜病变的相关关系。方法 在重庆地区汉族人群中选取100例2型糖尿病患者、98例糖尿病性视网膜病变患者和69例正常对照组，采用聚合酶链式反应-限制性内切酶长度多态性（PCR-RFLP）方法检测脂联素基因SNP+276的多态性位点，比较各组基因型及等位基因频率分布。结果 ①脂联素基因SNP+276在重庆地区汉族人群中存在三种基因型（G/G、G/T、 T/T），对照组的分布频率分别为42.0％、47.8％、10.1％，糖尿病无视网膜病变组的分布频率分别为53.0％、39.0％、8.0％，糖尿病性视网膜病变组的分布频率分别为42.9％、37.8％、19.4％。②对照组、糖尿病无视网膜病变组及糖尿病性视网膜病变组三组脂联素基因SNP+276基因型分布频率比较差异无统计学意义。③对照组、糖尿病无视网膜病变组及糖尿病性视网膜病变组的G等位基因频率分别为65.9％、72.5％、61.7％；三组脂联素基因SNP+276等位基因的分布频率比较差异无统计学意义。结论 脂联素基因SNP+276多态性位点与重庆地区汉族人群中糖尿病性视网膜病变的发生无明显相关性。

    【关键词】  脂联素 限制性片段长度多态性 糖尿病性视网膜病变

    脂联素是新近发现的，由脂肪细胞分泌的蛋白质，具有改善胰岛素抵抗、抗动脉粥样硬化及抗炎的作用[1]。国外学者在2型糖尿病（diabetes mellitus，DM）患者中发现，有视网膜病变者血浆脂联素水平较无视网膜病变患者显著降低[2]，提示脂联素在糖尿病性视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）的发生、发展中起了一定作用。同时研究表明，脂联素基因SNP+276多态性与肥胖、胰岛素抵抗和2型糖尿病相关[3]。本研究从侯选基因的角度出发，分析重庆地区汉族人群脂联素基因SNP+276 G/T的基因型分布，探讨该多态性与糖尿病性视网膜病变的相关关系，进而寻找糖尿病性视网膜病变新的易感基因，为糖尿病性视网膜病变易感人群的一级预防提供遗传学依据。

    1  对象和方法

    1.1  研究对象  在重庆地区汉族人群中，选择有2个或2个以上2型糖尿病患者的157个家系进行家系调查，对先证者的父母﹑同胞﹑子代进行口服75 g葡萄糖耐量实验（OGTT）。根据糖耐量结果，按照1999年WHO与美国糖尿病协会(ADA)认可的糖尿病诊断及分型标准进行诊断有无糖尿病。其中空腹静脉血浆葡萄糖浓度≥7.0 mmol/L（126 mg/dl）或糖耐量试验（OGTT）口服75 g葡萄糖后2 h静脉血浆葡萄糖浓度≥11.1 mmol/L诊断为糖尿病。对所有诊断为糖尿病的患者进行充分散瞳后详细检查眼底，必要时做荧光素钠眼底血管造影，按照第三届全国眼科会议通过的诊断标准，确定被检者有无糖尿病性视网膜病变。选取正常对照组患者69例，其中男33例，女36例，平均年龄(54.90±14.08)岁，体重指数（23.07±3.23）kg/m2。糖尿病患者无视网膜病变者100例，其中男44例，女56例，平均年龄(55.16±10.83)岁，体重指数(24.28±3.11)kg/m2。糖尿病伴视网膜病变者98例，其中男39例，女59例，平均年龄(61.67±11.84)岁，体重指数(24.06±3.88)kg/m2。各组中每例对象均来自不同的家系，个体之间无血缘关系。所有对象心、肝、肾功能正常，且均来自重庆地区汉族人群。

    1.2  标本采集  抽取受试者空腹静脉血5 ml，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，3000 r/min离心10 min，分离白细胞层，用于提取外周血基因组DNA。

    1.3  方法

    1.3.1  DNA的制备及扩增  按照美国Axyprep 生物公司提供的全血基因组DNA微量提取试剂盒说明，进行DNA的抽提。从Genebank中查取人APM-1基因序列，用Primer 5软件进行在线引物设计，合成片段长452 bp。上游引物为5’ GAT GGA CGG AGT CCT TTG TAG GTC 3’，下游引物为5’ CCA  AAT CAC TTC AGG TTG CTT ATG 3’。PCR反应体系：DNA模板4 ?滋l，10×Taq Buffer 2.5 ?滋l，d NTP  Mixture 0.5 ?滋l，Taq酶0.5 ?滋l，上下游引物各1 ?滋l，dd H2O 补足25 ?滋l。PCR反应条件：94℃预变性  3 min，95℃变性45 s，53℃退火45 s，72℃延伸    1 min，32个循环后72℃延伸10 min。PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下检测扩增结果。

    1.3.2  多态性基因分型  SNP+276G→T多态性检测均采用PCR-RFLP方法。PCR产物用Bsm Ⅰ内切酶经37℃水浴16 h消化后，行2％琼脂糖凝胶电泳，即得到该SNP的基因分型结果。

    1.4  统计学方法　 计算Hardy-Weinberg 平衡以判断样本的代表性。实验数据中计量资料数据以x±s表示，所有统计学分析均采用SPSS11.5分析软件。各组间一般临床资料比较采用方差分析（非正态分布的数据经对数转换后比较），两组间的比较采用SNK法。SNP 位点的等位基因频率在组间的差异分析采用χ2检验。

    2  结果

    2.1  三种基因型酶切产物电泳结果（见图1）  酶切产物经2％琼脂糖凝胶电泳分离后，仅出现452 bp条带的基因型为纯合子TT，同时出现82 bp、370 bp条带的基因型为纯合子GG，同时出现82 bp、370 bp、452 bp的基因型为杂合子GT。

    2.2  三组等位基因及基因型分布频率（见表1）  各组等位基因及基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。从表1中可见本研究人群中糖尿病和糖尿病性视网膜病变组脂联素基因SNP+276的基因型分布以GG为主。根据等位基因的计算公式算出各组中G、T等位基因的频率，可见三组均以G等位基因常见。各组间基因型频率及等位基因频率差异均无统计学意义（χ2=8.153，P=0.086；χ2=5.247，P=0.073）。

    3  讨论

    糖尿病性视网膜病变是糖尿病最为常见和严重的微血管并发症之一，并将成为成人低视力和盲目的主要病因。多年来的研究认为糖尿病病程及其血糖控制情况是视网膜病变发生、发展的重要原因之一。然而，许多临床观察显示：有些患者即使代谢控制良好也不能完全预防其发生，有些患者长期处于高血糖状态却不发生视网膜病变；有些患者在糖尿病早期即出现视网膜病变，而有些患者糖尿病病程长达数十年却不发生视网膜病变，这就表明遗传因素在糖尿病性视网膜病变的发生、发展中起了关键性的作用[4]。土耳其学者测定了糖尿病性视网膜病变患者的血浆脂联素水平，发现患者的脂联素水平明显低于糖尿病患者和健康正常人，认为血浆脂联素水平可能与糖尿病性视网膜病变的发生有一定联系[2]，因此有必要将脂联素基因作为候选基因，探讨其在糖尿病性视网膜病变中的可能作用。

    脂联素是由脂肪组织特异性产生的蛋白质，具有增加胰岛素的敏感性、抗动脉粥样硬化以及抗炎的作用。编码人脂联素的基因是APM-1，位于第3号染色体q27区，包含3个外显子和2个内含子，全长17 kb [5]。脂联素全基因组扫描显示，该区域同时是2型糖尿病、代谢综合征和冠心病的易感基因位点[6-8]。脂联素基因存在多个突变位点，目前己检测到一是发生在外显子3的4个错义突变(R112C，I164T，R221S和H241P)，一是发生在外显子2(+45位点、+276位点)的多态性——同义突变(GGT-GGG)。

    本研究采用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性分析技术，对重庆地区人群脂联素SNP+276与2型糖尿病性视网膜病变进行关联性研究。结果表明，脂联素SNP+276的基因型(GG、GT、TT)与等位基因(G、T)的频率与文献报道的日本人该位点基因和基因型频率[9]相近，脂联素SNP+276基因型的分布在糖尿病患者伴或不伴视网膜病变及正常对照组之间差异均无统计学意义。同样，日本学者Yoshioka等[10]在对444名日本人进行脂联素SNP+276的研究中也发现，脂联素SNP+276基因型和等位基因的分布频率在DR与NDR患者之间差异无统计学意义（P=0.63）。提示脂联素基因G276T多态性可能与2型糖尿病性视网膜病变的发生不相关，即它可能不是2型糖尿病性视网膜病变的主要遗传标志。导致这种结果的原因可能为：糖尿病性视网膜病变的发生与病程、代谢控制及遗传等多种因素有关，脂联素SNP+276所起的作用可能被上述因素所削弱。此外，本研究资料中由于伴增殖性糖尿病性视网膜病变的患者较少，尚无法对该基因多态性与视网膜病变进展过程(单纯型-增殖型)间的相关性作分析。

    本研究资料还显示，脂联素SNP+276的基因型、等位基因频率在2型糖尿病患者与正常对照组间差异也无统计学意义，提示脂联素SNP+276与2型糖尿病的发生亦不相关，该多态性可能也不是2型糖尿病发病的遗传学基础。同样有学者在对法国高加索人的研究中，也未发现SNP+276位与2型糖尿病和胰岛素抵抗的相关性[11]。然而Hara等[9]研究发现，日本人2型糖尿病人群中SNP+276 G等位基因型频率高于非糖尿病患者群；SNP+276 G/G基因型发生2型糖尿病的危险性增加，优势比为2.16；脂联素基因+276位为GG基因型的个体，与+276位为TT基因型的个体相比，2型糖尿病的发病危险明显升高。另外，+276位GG基因型个体较+276位TT基因型个体的胰岛素抵抗指数高，在体重指数超过正常的个体中，+276位G等位基因与血浆脂联素浓度呈线性负相关[9]。在意大利高加索人中也发现，APM-1基因SNP+276位G>T与高体重指数和高胰岛素抵抗指数相关，也与血浆脂联素水平有关[12]。在各种人群中得到的研究结果不尽一致，可能是由于不同人种因不同地理、环境、遗传因素造成对2型糖尿病的易感性不同所致，在不同人种中由于遗传背景和环境因素影响，APM-1基因中有不同的遗传变异。也有可能是由于在不同人群中等位基因的关联和疾病表现型的实质性差别有关[11]。

    总之，我们的研究结果发现，在重庆地区汉族人的2型糖尿病患者中，脂联素SNP+276与糖尿病性视网膜病变的发生无明显相关性。但由于不同人种中脂联素基因多态性存在着差异，因而还需在其他种族中研究该基因多态性与2型糖尿病性视网膜病变的关系。同时，由于本研究仅仅是脂联素SNP+276的基因分型结果，因此脂联素基因是否为中国人2型糖尿病及其糖尿病性视网膜病变的易感基因还必须对该基因的全部多态性进行全基因分析才能作出准确的评价。

    【参考文献】

    [1] Stefan N， Stumvoll M. Adiponectin—its role in metabolism and beyond[J]. Horm Metab Res，2002，34（9）：469-474.

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    [3] Menzaghi C， Ercolino T， Di Paola R， et al． A haplotype at the adiponectin locus is associated with obesity and other features of the insulin resistance syndrome[J]． Diabetes，2002，51(7)：2306-2312.

    [4] Chowdhury TA， Dyer PH， Kumar S， et al． Genetic determinants of diabetic nephropathy[J]. Clin Sci，1999，96(3)：221-230．

    [5] Takahashi M， Arita Y， Yamagata K， et al． Genomic structure and mutations in adipose-specific gene，adiponectin[J]． Int J Obes Relat Metab Disord，2000，24(7)：861-868.

    [6] Vionnet N， Hani EH， Dupont S， et al. Genomewide search for type 2 diabetes-susceptibility genes in French whites：evidence for a novel susceptibility locus for early-onset diabetes on chromosome 3q27-qter and independent replication of a type 2-diabetes locus on chromosome 1q21 24[J]. Am J Hum Genet，2000，67(6)：1470-1480.

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