2  结果

    2.1  排斥时间  排除了麻醉过量、虹膜嵌顿及前房出血等的病例，A组有8只，A0组有8只，B组有9只，C组有7只，D组有8只。晶状体混浊不影响结果的情况下可不排除。裂隙灯观察发现，术后前三天各组角膜植片均透明，有轻度水肿，角膜缘血管开始向中央生长，B、C、D组血管密度较A、A0组稀疏。随后A、A0组新生血管进展较快，血管密度相对较高，水肿加重，很快出现混浊，7～9 d时血管达植片周边，出现排斥反应。B、C、D组新生血管发展相对缓慢，血管也稀疏，有些角膜水肿还有减轻趋势，混浊发展较轻、较慢。A、A0组出现排斥反应后新生血管继续向角膜中央生长，血管增粗，像树枝状迂曲进展，角膜混浊水肿加剧。第21天时血管继续生长，混浊加重，但水肿减退。B、C及D组这一过程相对滞后，C组术后14 d左右出现排斥反应，B、D组17~18 d左右出现。由于前房炎症反应，有些晶状体在观察过程中出现逐渐混浊。各组统计结果如表1。

    A0组与A组相比，差异无显著性（P>0.05）；B、C、D组与A组相比，差异有显著性（P<0.01）；C组与B、D组相比，差异有显著性（P<0.01）；B组与D组相比，差异无显著性(P>0.05)。

    2.2  IFN-γ的电泳结果  图1显示了A、B两组IFN-γ mRNA的表达结果，可见角膜移植术后第7天时，A组角膜植片IFN-γ mRNA可检测到有高表达，而B组角膜植片IFN-γ mRNA的表达量很少或检测不到，两组之间的差异较为明显。

    2.3  HE染色观察  正常大鼠角膜较薄，可见上皮约有五层细胞，表面两层呈扁平样，中间两层稍厚，基底层呈立方形，上皮层约占整个角膜厚度的2/5。大鼠角膜缺乏前弹力层，基质层胶原纤维板层数较少，角膜基质细胞均匀分布于纤维板之间，核被染成深蓝色，后弹力层HE染色呈红色，内皮细胞单层，扁平样。A组移植术后第3天可见角膜植片轻度水肿，上皮脱落，角膜基质细胞消失，基质内一些多核白细胞浸润，有些标本植片植床交界处可见上皮增生，上皮层数增加至7～8层。第7天可见植片角膜上皮已生长，但仅2～3层，植床植片交界及植片周边角膜上皮增生可达8～9层。基质内见大量淋巴细胞、中性粒细胞及单核吞噬细胞浸润，周边可见新生血管，角膜基质水肿增厚，胶原纤维板层结构紊乱，内皮细胞减少，缝线周围可见异物反应样大量淋巴细胞环绕（见图2）。第14天见植片及周边植床上皮层继续增生甚至可达十多层，植片上皮可见空泡样改变及崩解坏死，基质胶原纤维板层结构已丧失，大量细胞浸润，大量新生血管，同时可见大量纤维细胞自植片周围向中央增生，多位于上皮下，角膜逐步瘢痕化，有些部位可见坏死改变，基质水肿进一步加重，后弹力层皱褶，内皮细胞基本不见。第21天可见上皮增生减弱，基质内纤维细胞进一步增多，细胞浸润及基质水肿较第14天减轻。B、C组与A组相比，第3天植片情况基本相同，但随后的发展较A组缓慢，且细胞浸润，基质水肿，新生血管程度相对较轻（见图3）。D组第3天时可见植片上皮存在，但仅有2～3层，余情况同B组。

    2.4  血清IL-2的浓度  正常SD大鼠血清IL-2浓度为(35.18±2.59)pg/ml，移植术后第3天见各组之间IL-2浓度差异无显著性（P>0.05）；第7天时A组明显升高，B、C、D组也较第3天时升高，但幅度较A组低（P<0.05），三组之间差异无显著性；第14天时A组血清IL-2的水平达高峰[(105.52±20.66)pg/ml]，B、C、D组升高幅度与A组相比明显较低（P<0.05），C组与B、D组相比升高幅度较大（P<0.05），B、D两组之间无明显差异（P>0.05）；第21天时A组IL-2水平下降，B、C、D组也略有回降，但A组与B、C、D组相比IL-2水平仍较高（P<0.05），C组比B、D组IL-2水平高（P<0.05），B、D两组之间无明显差异（P>0.05）。详见表2。

    3  讨论

    DC是一类具有最强抗原提呈功能的异质性细胞群体，是激发机体免疫反应的最原始的细胞，近年来的研究不断证实，DC是移植排斥反应的重要参与者。从理论上讲，减少或去除DC可减弱抗原的递呈过程和植片的免疫原性，从源头上抑制排斥反应。曾有学者用抗DC单克隆抗体来进行抑制皮肤、脾脏及心脏等移植排斥反应的实验研究[2-4]，取得了成功。以往有学者在角膜移植术前通过紫外线照射    （75 mJ/cm2）和高压氧等方法减少或去除供体内DC可增加植片的存活率[5-6]，但这些方法均有一些缺陷。本研究用抗DC单克隆抗体抑制DC，观察了其对大鼠角膜移植排斥反应的影响，发现可显著抑制排斥反应，延长植片的存活时间。

    本实验设置阳性对照组A0，使用非特异性小鼠抗大鼠抗体，结果与对照组A相比无差异性，可排除单抗蛋白本身引起的排斥反应干扰。实验中发现结膜下给药组停药后，排斥反应发展较腹腔给药组迅速，分析其可能原因是：①因大鼠结膜下空间小，结膜下给药量有限。②结膜下给药仅作用于局部，不能抑制全身的DC，一旦停药，很快有DC进入角膜植片摄取抗原。而腹腔给药可抑制全身DC，停药后，DC再生需要一定时间。

    本实验采用了20%酒精来制作上皮瓣，实验结果显示，与常规角膜移植组相比，保留自体上皮瓣组虽然出现排斥反应的时间稍长，但无统计学意义。这可能是因为抗体本身已将DC的作用抑制，因此植片内抗原性的多少已不重要。

    本实验HE染色结果显示：早期有少量中性粒细胞是术后非特异性炎症反应，术后角膜上皮缺失，只有D组（即保留自体角膜上皮组）角膜上皮有2~3层细胞，上皮缺失的原因可能是术后上皮缺乏神经营养，再加上手术创伤、大鼠眼球较外突、眨眼次数少，均可致上皮脱失。另外排斥反应也可导致上皮的脱落。D组上皮尚有2～3层细胞，可能与保留的是自体上皮有关。术后还可见角膜基质细胞消失，可能是手术创伤导致细胞凋亡所致，正如研究发现，外伤、准分子激光术后，损伤周围角膜基质细胞凋亡。病理切片还发现，A组第14天时水肿、炎症浸润最重，第21天时水肿减轻，大量纤维细胞和植片逐步瘢痕化，与裂隙灯观察结果一致。治疗组排斥反应相对较轻，出现时间较晚，水肿、新生血管、细胞浸润均较轻。HE染色还可见缝线周围细胞浸润明显，围绕缝线呈环行排列，缝线对排斥反应有促进作用。

    IFN-γ主要由活化的Ｔ细胞(包括Th0、Th1细胞和几乎所有的CD8+ Ｔ细胞)和NK细胞产生。IFN-γ在排斥反应中的作用是多方面的，可激活中性粒细胞功能和ＮＫ、巨噬细胞杀伤活性，使之在细胞因子的介导下，产生排斥反应，它不仅可以增加移植物MHCⅠ类和Ⅱ类抗原的表达，而且可以使正常情况下不表达MHCⅡ类抗原的细胞表达MHCⅡ类抗原，增加了移植物的识别和破坏。另外，IFN-γ还可以使巨噬细胞活化，促进Ｔ细胞增殖，诱导促炎细胞因子的分泌[7]。

    很多研究显示IFN-γ可作为急性排斥反应的指标[8-10]。本研究用RT-PCR的方法检测了角膜移植术后第7天时，未经治疗和抗DC单抗治疗后角膜植片IFN-γ的表达情况，发现未经治疗的角膜植片高表达IFN-γ，而在给予抗DC单抗进行免疫抑制治疗的植片IFN-γ表达很少，甚至检测不到。检测不到的原因可能是：①植片未表达IFN-γ。②表达的量较少，再加上RT-PCR方法取的样本量也较少，故检测不出。本研究结果从mRNA水平说明了抗DC单抗可有效降低免疫排斥反应的发生，延长植片存活时间。

    IL-2主要由CD4+和CD8+ Ｔ细胞产生，此外NK细胞和淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)亦可产生，是机体重要的免疫调节因子，具有广泛的免疫调控和免疫增强作用，并参与抗肿瘤效应和移植排斥反应，在急性排斥反应中表达显著。Daane等[11]发现在人心脏移植心肌活检标本培养的Ｂ细胞抗原刺激的心肌浸润细胞可产生较高水平的IL-2。vanEmmerik等[12]的研究结果表明，人心脏移植心肌活检标本的心肌细胞培养所产生的IL-2与移植排斥成正相关。

    本研究发现，虽然移植的角膜组织与其他移植器官相比非常小，但仍可引起血清中IL-2浓度水平的显著升高。A组角膜移植术后第3天血清IL-2的浓度即有所升高，但与正常值相比差异无显著性，第7天时升高显著，第14天达最大峰值，第21天回降。与A组裂隙灯观察结果相一致。经抗DC单抗治疗后，血清IL-2的水平与对照组相比明显较低，说明抗DC单抗能减少角膜移植术后血清IL-2的水平，从而降低排斥的严重程度，延长排斥反应发生的时间。同样，我们发现结膜下注射组C组第14及第21天时血清IL-2的含量要高于腹腔注射组B、D组，与裂隙灯观察结果相一致。临床上，角膜移植发生排斥反应时，我们不可能像其他器官移植一样取一小块组织进行活检，进行证实。因此，检测血清中细胞因子的变化可望成为判断角膜移植术后排斥反应的有无、程度及免疫抑制治疗疗效的一种方法。

    【参考文献】

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    [3] 邵启祥，许化溪，刘恭植，等. 大鼠DC单抗应用于移植排斥反应的初步研究[J]. 免疫学杂志，1994，10（3）：165-167.

    [4] 陈天宇，姜洪池，孙备. 脾移植前去除成熟树突状细胞预防移植排斥反应的体外研究[J]. 中华肝胆外科杂志，2000，6（5）：361-364.

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    [11] Daane CR， vanBesouw NM， vanEmmerik NK， et al. Discrepancy between mRNA expression and production of IL2 and IL4 by cultured graft in filtrating cells propagated from endomyocardial biopsies[J]. Transpl Int，1994，7(Suppl 1)：S627-628.

    [12] vanEmmerik NK， Baan C， Vaessen L， et al. Cytokine gene expression profiles in human endmyocardial biopsy(EMB) derives lymphocyte culures and in EMB tissue[J]. Transpl Int， 1994，7(Suppl 1)：S623-626.

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