作者：刘双珍 作者单位：中南大学湘雅医院 眼科，湖南 长沙 410078；
【摘要】 目的 对豚鼠行形觉剥夺建立近视动物模型，观察离子型谷氨酸受体N－甲基－D－天冬氨酸受体1(N-methyl-D-aspartate receptor 1，NMDAR1)在近视豚鼠视网膜上的动态表达，探讨其在近视发病机制中的作用。方法 60只三色豚鼠随机分为3组：未遮盖组（Ⅰ）、单眼遮盖2周组（Ⅱ）、单眼遮盖3周组（Ⅲ），其中右眼遮盖为实验眼，左眼为自身对照眼。对各组进行视网膜检影和A超测眼轴，分别运用免疫组化及 Western Blotting法检测各组豚鼠视网膜NMDAR1蛋白表达。结果 Ⅰ组双眼呈轻度远视状态，双眼眼轴差异无显著性（P>0.05）；Ⅱ组实验眼呈轻度近视（-1.583±1.478）D，自身对照眼呈轻度远视（2.500±1.017）D;实验眼眼轴较自身对照眼轻度延长（P<0.05）；Ⅲ组实验眼呈中度近视 (-3.417±1.169）D，自身对照眼呈轻度远视（1.813±1.072）D；实验眼眼轴较自身对照眼明显延长（P<0.05）。免疫组化显示NMDAR1主要表达在豚鼠视网膜的内核层细胞及神经节细胞。Ⅰ组实验眼视网膜上NMDAR1蛋白含量为0.338±0.314，Ⅱ组实验眼NMDAR1蛋白含量升高为0.464±0.280，Ⅲ组实验眼视网膜NMDAR1蛋白含量明显上调为0.635±0.037；实验眼视网膜上NMDAR1蛋白含量随遮盖时间延长明显上调，与自身对照眼比较差异有显著性（P<0.05）。结论 形觉剥夺可明显上调豚鼠视网膜NMDAR1的蛋白表达，形觉剥夺产生的异常视觉信号可能通过刺激谷氨酸的释放、NMDAR1过度生成，参与近视的调控。
【关键词】 形觉剥夺性近视 视网膜 豚鼠 N－甲基－D－天冬氨酸受体1 谷氨酸
在视觉发育可塑性关键期，对实验动物予以形觉剥夺，可引起视网膜第一信使改变，并通过一定的信号传导途径作用于靶细胞发挥效应，形成近视。以往对形觉剥夺性近视（form-deprivation myopia, FDM）的研究显示视网膜上多种信息分子均可能与眼轴生长及视觉发育有关。谷氨酸作为视网膜垂直信号传递系统的最重要的兴奋性氨基酸神经递质，可通过与N－甲基－D－天冬氨酸受体 (N-methyl-D-aspartate recepter，NMDAR)结合，在视觉可塑性变化、视网膜环路发育、兴奋性突触传递及视网膜电化学信号的传递中发挥重要作用[1]。本研究通过观察FDM豚鼠视网膜上谷氨酸受体NMDAR1的表达，探讨谷氨酸及其受体在近视发病机制中的作用。
1 材料和方法
1.1 实验动物与分组 3周龄三色豚鼠(购自中南大学动物部动物研究所)60只,随机分为3组，每组20只。Ⅰ组：未遮盖组，Ⅱ组：右眼遮盖2周组，Ⅲ组：右眼遮盖3周组。
1.2 实验方法
1.2.1 形觉剥夺性近视（form-deprivation myopia，FDM）模型的建立 右眼为实验眼，予以不透明眼罩遮盖形觉剥夺；左眼为自身对照眼[2]。
1.2.2 屈光度检测 在实验前、实验第2周、实验第3周对各组进行屈光度检查。检查前1 h双眼滴0.25%托吡卡胺眼液以麻痹睫状肌，验光师行双盲法暗室内视网膜检影镜检影，每只眼检影3次，取平均值测眼屈光度数,有散光者用等效球镜表示。
1.2.3 眼轴长度检测 在各实验时间对各组豚鼠以1%的卡因进行眼球表面麻醉,用A超测定眼轴长度，连测3次,取平均值。
1.2.4 免疫组化 各实验时间行屈光度与眼轴测量后每组随机取10只豚鼠断颈处死，快速摘除双侧眼球，去除玻璃体及眼前段，将后极部视网膜置于10%中性福尔马林液中常规固定、脱水、石蜡包埋、切片。脱蜡入水，浸入室温下3%H2O2中10 min，PBS洗3 min×3次；0.01 M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）微波炉加热沸腾后2 s断电，切片浸入枸橼酸盐缓冲液的密闭微波炉内焖5 min，再将微波炉加热 20 s断电，再焖40 min，自然冷却；滴加正常血清封闭液37℃烤箱30 min，0.5 ?滋g/ml鼠抗NMDAR1多克隆抗体(购于美国Chemicon公司)，4℃过夜；PBS洗3 min×3次；滴加羊抗鼠IgG，37℃烤箱30 min， 0.1 M PBS洗3 min×3次，滴加SABC，37℃烤箱 30 min，0.1 M PBS洗3 min×3次，DAB显色，镜下控制显色时间，苏木素复染，封片下光镜观察。结果判定：胞浆呈明显棕色反应为阳性,根据染色深浅和阳性细胞百分比, 将阳性强度判断为弱阳性(+)、阳性(++)、强阳性(+++)。
1.2.5 视网膜总蛋白提取 将各组余下的10只豚鼠断颈处死，摘除双侧眼球，去除玻璃体及眼前段，剥离后极部视网膜并用电子天平称重，无菌研钵内加液氮，将视网膜研碎后转入EP管；按1 ∶ 8重量体积比于EP管内加入对应视网膜重量的组织裂解液，冰浴上塑料研棒进一步研磨裂解视网膜组织 1 h。冰上超声裂解，每次3 s，间隔1 s，超声2次；EP管置沸水浴中5 min。12000 r/min，4℃离心15 min，吸取上清至另一管中，分装成小管存于-20℃。
1.2.6 Western Blotting分析 参照《分子克隆实验指南》第2 版，BCA法测定蛋白浓度，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移法转移蛋白至PVDF 膜上，丽春红S染色，对比蛋白质Marker将所需测定片断和β-actin片断滤膜剪下，5%脱脂牛奶封闭液室温下孵育4 h，洗膜液洗膜5 min×3次，封闭液稀释的一抗NMDAR1(1:100)4℃ 振摇过夜。洗膜液洗膜 5 min×3次，加入封闭液稀释的羊抗鼠IgG二抗 （1 ∶ 500），37℃孵育2 h。倾去二抗，用洗膜液洗膜 5 min×3次，加DAB显色。用ImageJ1.36图像分析软件对结果灰度扫描，以β-actin做内对照进行校正，计算目的蛋白的相对表达量。计算方法为：目的蛋白质相对表达量＝目的蛋白条带灰度值/β-actin条带灰度值。
1.3 统计学方法 采用SPSS11.0统计软件包，组间差异用one way ANOVA检验，两两比较采用LSD法检验; 左右眼差异应用配对t检验比较。
2 结果
2.1 屈光度变化 形觉剥夺可明显促进近视形成和发展。未遮盖组，双眼呈轻度远视状态；遮盖2周组实验眼呈轻度近视（-1.583 D）；遮盖3周组，实验眼呈中度近视状态(-3.417 D)。各组自身对照眼屈光度无明显变化(见表1)。
2.2 眼轴长度变化 形觉剥夺可明显促进眼轴生长。未遮盖组，双眼眼轴差异无显著性；遮盖2周组实验眼眼轴[（7.958±0.118）mm]轻度延长；遮盖3周组，实验眼眼轴[（8.123±0.118）mm]明显延长。各组自身对照眼眼轴随豚鼠的生长发育逐渐延长(见表2)。
2.3 NMDAR1免疫组化结果 Ⅰ组实验眼视网膜上NMDAR1蛋白表达呈弱阳性，在内核层（inner nuclear layer，INL）、神经节细胞层（ganglion cell layer，GCL)中少量细胞胞浆呈淡黄色着色, 外界膜（external limiting membrane，ELM）呈线样淡黄色着染；Ⅱ组实验眼视网膜上NMDAR1蛋白表达呈阳性，INL、GCL中部分细胞胞浆黄色着色，内丛状层（inner plexiform layer，IPL）、神经纤维层（nerve fiber layer，NFL）及外界膜黄色着色；Ⅲ组实验眼视网膜NMDAR1蛋白表达为强阳性，呈棕黄色着色，以INL、GCL最明显，甚至光感受器细胞层（photoreceptor layer，PRL）和外丛状层（outer plexiform layer，OPL）也有明显着色。自身对照眼视网膜中NMDAR1蛋白表达随个体生长发育染色渐增强，但比同组实验眼明显减弱（见图1）。
2.4 NMDAR1的Western Blotting结果 形觉剥夺能明显增加NMDAR1蛋白表达水平。未遮盖组，双眼NMDAR1蛋白表达水平差异无显著性（P>0.05）；遮盖2周组，实验眼NMDAR1蛋白表达水平较自身对照眼增加，差异有显著性（P<0.05）；遮盖3周组，实验眼NMDAR1蛋白表达水平较自身对照眼明显上调，差异有显著性（P<0.05）。各组自身对照眼随时间的延长和个体发育，NMDAR1蛋白表达也逐渐增加，差异有显著性（P<0.05）（见图2、表3）。
3 讨论
自1977年Wiesel 和Raviola首次成功建立了FDM动物模型后，近视的发病机制研究取得了突破性的进展。在动物视觉发育敏感期内遮盖单眼，造成单眼全视野形觉剥夺，能刺激眼球过度生长、眼轴延长和近视形成。在以往对FDM研究中发现视网膜上许多神经递质和生长因子等均可能与眼轴生长及视觉形成有关，但这些第一信使究竟哪些才是近视关键的启动因子，它们又是通过激活何种视网膜信号传导通路来传递信息，进而调控近视的发生发展成为研究的热点。
研究显示，谷氨酸作为视网膜内最重要的兴奋性神经递质，可能由双极细胞轴突末梢或部分无长突细胞及神经节细胞释放，在病理或生理状态下作用于突触后膜上的谷氨酸受体，并迅速被酶降解，由神经元、神经胶质细胞重摄取清除而发挥其生理功能[3]。NMDAR是一种重要的谷氨酸离子型受体复合物，其中NMDAR1是受体复合物的功能亚单位[4]。谷氨酸是NMDAR1最强的内源性激动剂，病理状态下NMDAR1被谷氨酸激活后，可导致细胞内Ca2+超载，并通过激活一氧化氮—环磷酸鸟苷等信号系统发挥其生物学效应[4]。
NMDAR1广泛分布于整个中枢神经系统的神经元，它与视觉系统的发育、神经元的存活及突触可塑性密切相关。在我们的试验中发现，3周正常豚鼠视网膜上有NMDAR1的表达，内核层（ONL）、神经节细胞层(GCL)内均有阳性着色，外界膜呈一条线样着色。外界膜是Müller细胞与光感受器突触连接点所构成的平面，主要为Müller细胞的浆膜组成。这表明视网膜上神经节细胞、双极细胞、Müller细胞、无长突细胞可能通过释放谷氨酸并与NMDAR相结合发挥生理病理效应。Brandstatter原位杂交法显示在大鼠神经节细胞、双极细胞、无长突细胞上均有NMDAR1的表达[5]。在视网膜内层中,出生后第9天的大鼠视网膜on/off 型细胞上就有NMDAR1的微弱表达[6]。本实验显示，在正常视觉环境下，3周豚鼠视网膜NMDAR1表达呈弱阳性，双眼差异无显著性；随个体发育对照眼NMDAR1表达在蛋白水平有所增加，免疫活性显示OPL、IPL上表达均有增强，这可能与豚鼠视觉发育，突触的增加有关。
Fischer等[7]用人工合成的拟兴奋性氨基酸药物NMDA对小鸡行玻璃体腔内注射，可诱导小鸡近视形成；NMDAR拮抗剂Dextromethorphon、MK801、AP5等均能有效抑制小鸡的形觉剥夺性近视[8]。我们的实验显示，对豚鼠形觉剥夺能明显上调NMDAR1的表达，实验眼随遮盖时间延长，近视形成，视网膜NMDAR1蛋白表达水平上调。在视觉形成的过程中，外界视觉信号通过视网膜上光感受细胞—双极细胞—神经节细胞三级神经元传达神经冲动至视皮质形成视觉。谷氨酸作为视网膜兴奋性神经递质表达的主要部位为视网膜内层的神经细胞，本实验提示谷氨酸可能是近视形成过程中作为启动因子的第一信使，形觉剥夺的异常信号可能引起谷氨酸的过量释放，刺激视网膜内层细胞上NMDAR1的过度生成，并通过一定的视网膜信号途径传递视觉信号，参与近视的调控。而该信使究竟是通过何种视网膜信号通路发挥效应仍需继续深入研究。
【参考文献】
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[8] Fischer AJ，Seltner RL，Stell WK. Opiate and N-methyl-D- asparatate receptors in form-deprivation myopia[J]. Vis Neurosci，1998，15(6)：1089-1096. |
