作者:张俊霞,张德秀,刘思伟,刁鹏飞,陈丽 作者单位:(710061)中国陕西省西安市,西安交通大学医学院第一附属医院眼科
【摘要】 目的:建立牛眼小梁细胞体外培养体系,观察高浓度葡萄糖对小梁细胞的影响,研究高糖与开角型青光眼(primary open angle glaucoma,POAG)以及糖尿病与POAG之间的关系,探讨糖尿病开角型青光眼的发病机制,从而为指导开角型青光眼的临床用药提供重要依据。方法:以新鲜牛眼为材料,分离并培养小梁细胞,用光学镜、电镜观察正常小梁细胞的形态。将传至第3代的小梁细胞制作成细胞悬液、计数并接种于培养板(或培养瓶)中,待细胞贴壁后,将细胞分为两组:对照组(葡萄糖浓度为5.5mmol/L)和高糖组(葡萄糖浓度为35mmol/L),分别培养7d后收集细胞,用透射电子显微镜、MTT法、流式细胞仪(FCM)检测法,研究高糖对小梁细胞形态、增殖和凋亡的影响。结果:高糖组与对照组相比较,小梁细胞胞浆内细胞器减少,内质网、高尔基复合体、线粒体等细胞器肿胀,溶酶体及脂肪滴增多,核浆比减小,可见凋亡小体;高浓度葡萄糖对小梁细胞的增殖有明显的抑制作用,能够促进小梁细胞的凋亡,均有统计学意义(P<0.05)。结论:高糖可能通过使小梁细胞的增殖能力下降,凋亡率增加,使近管小梁网的网状结构改变,网孔变小,改变房水流出途径的阻力导致眼内压升高,可能是糖尿病患者POAG发病率增高的原因之一。
【关键词】 牛眼小梁细胞 高糖 细胞培养 开角型青光眼 增殖 凋亡
0引言 原发性开角型青光眼(primary open angle glaucoma,POAG)是一种较常见的致盲性眼病,糖尿病是其危险因素之一。Rozsa等[1]研究发现糖尿病患者中糖含量较正常人的明显增高(正常约为3.2mmol/L,糖尿病患者约为7.8mmol/L)。Sato等[2]动物实验证实糖尿病小鼠房水中糖含量为无糖尿病小鼠的2~3倍。在糖尿病患者中POAG的发病率为4%~11%,约为非糖尿病人患者青光眼的3倍[3],在POAG患者中6%~13%有糖尿病[4],因此,糖尿病与POAG间的关系较为密切。然而糖尿病患者并发POAG的发病机制尚不明确。有研究发现,高糖条件下,小梁细胞外基质成分明显增多,导致房水流出阻力增加[57]。但尚没有高糖对小梁细胞影响的研究,我们主要研究高糖条件下,小梁细胞在形态及增殖等方面的变化,从而进一步探讨糖尿病与POAG之间的关系。
1材料和方法
1.1样本来源与分离小梁网 于屠宰场取现杀健康新鲜小牛眼,牛龄<24mo,取材后用4℃冰桶在1h内运回实验室。剪除眼球附属组织,进行清洗及消毒后。于超净台的无菌培养皿中分离小梁网,将分离浸洗后的小梁组织剪成0.5mm2大小碎块,分别移入100mL培养瓶,组织块以3~5mm间距为佳。
1.2小梁细胞培养 运用改良方法[810],待小梁细胞游离出组织块后,每3d换液1次。至细胞长至融合期并铺满瓶底时,加入适量1.25g/L的胰蛋白酶和0.2g/L的EDTA消化传代,以1∶2比例传代。选择3~5代细胞进行实验研究。
1.3光镜标本制备 将传3代细胞接种在盖玻片上,培养1~2wk后取出,用0.01mmol/L PBS清洗3次,空气晾干,分别进行瑞士姬姆萨(WrightGiemsa)、考马斯亮蓝(coomassie BB)R250,异硫氰酸萤光素鬼笔环肽(Fluorescien Isothioeyante FiTCphalloidin)染色,封片干燥后用系统生物显微镜(Olympus)观察、拍照。
1.4电镜标本制备 将传3代细胞的接种在4个25mL培养瓶中,待细胞达汇合后,用0.01mmol/L PBS清洗3次,随机分为两组,分别加入含不同葡萄糖浓度(5.5,35mmol/L) 的DMEM培养液,培养7d后,用0.01mmol/L PBS清洗2次,1200转离心2min,将离心后的细胞取出后切成1mm3的小块,立即置于20g/L戊二醛固定液中4℃固定2h以上,0.1mmol/L磷酸缓冲液浸洗10min,乙醇梯度脱水,还氧丙烷置换10min;环氧树脂Epon 812浸透、包埋,聚合后作半超薄切片1~2μm,美蓝染色后光学显微镜下定位,超薄切片机(瑞典,LKB)进行超薄切片50~70nm,醋酸铀、柠檬酸铅染色后,在透射式电子显微镜(日本,H600)下观察、拍照。
1.5 MTT标本制备 传3代细胞接种于96孔培养板,1×105细胞/孔,每孔培养基总量200μL(以后每次换液均保持该培养基总量不变),EM在恒温培养箱中培养2wk细胞达汇合,用0.01mmol/L PBS清洗3次,随机分为两组,分别加入葡萄糖浓度为5.5mmol/L和35mmol/L的DMEM培养液,并以葡萄糖浓度为5.5mmol/L的DMEM溶液作为空白调零组,16孔/组,培养7d,加入MTT试剂(美国Sigma 公司),20μL/孔,加入二甲基亚砜DMSO(美国,GAYLORD)液,150μL/孔,继续培养4h,振荡5min后,以空白组调零,用全自动酶标仪(美国,Bio TEK)检测A值(检测波长490nm)。根据A值计算抑制率,抑制率=(对照组A值实验组A值)/(对照组A值)×100%。
表1 高糖对牛眼小梁细胞增殖(光密度值)的影响(略)
bP<0.01 vs对照组
1.6流式细胞术标本制备 将传3代细胞以1×104/mL密度接种于24孔培养板,在恒温培养箱中培养2wk细胞达汇合,用0.01mmol/L PBS清洗3次,随机分为两组,分别加入葡萄糖浓度为5.5mmol/L和35mmol/L的DMEM培养液,培养7d后,消化上述孔中的细胞并悬浮于16只小管中,调整各管中细胞数为1×106个。各管中细胞经洗涤并离心2次后悬浮,先后加入AnnexinV (Fitc标记) 5μL和碘化丙啶(propidine iodide,PI) 5μL避光反应15min,再加入Binding Buffer混匀,在30min内用流式细胞仪(美国,BD)测试。 统计学分析:所有数据均用SPSS 13.0软件建立数据库,数据以(±s)表示,采用t检验进行统计学分析,检验标准P<0.05时有统计学意义。
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