作者：杜蕊,吴洁,马吉献,朱秀萍,刘先宁,尹琳,程燕

    【Abstract】 AIM: To establish a rabbit model of fungal (aspergillus) keratitis and evaluate the role of confocal microscopy in early diagnosis. METHODS: Cornea slice, with a “#”shaped nick on its endothelium, was sewed onto acceptor cornea with 100 nylon thread. Aspergillus suspensions was injected into the space between cornea slice and acceptor cornea. Slit lamp microscopy, cornea scraping, confocal microscope, pathological section examination and culture were used at day 3, 7, 10 and 15  after aspergillus was inoculated. RESULTS: A rabbit model of fungal keratitis was built successfully and proved by cornea scraping, confocal microscopy, pathological section examination and culture.  In the early period (3 d after aspergillus injection), the straight, short, fewbranches and dense lightreflecting hypha, spore, and a little inflammatory infiltration  were found by confocal microscopy. In the metaphase (7, 10 d after aspergillus injection), a lot of hypha and inflammatory infiltration were discovered by confocal microscopy. In the anaphase (15 d  after aspergillus injection), a little hypha was found by confocal microscopy while it could not be found by cornea scraping and pathological section examination. CONCLUSION: A rabbit model of fungal keratitis was established successfully. Confocal microscopy provides an important basis for early diagnosis of fungal keratitis.

    【Keywords】 fungal keratitis; aspergillus; rabbits; animal model; confocal microscope

    【摘要】 目的：建立有色实验兔真菌性角膜炎动物模型，角膜共焦显微镜进行早期诊断. 方法：应用内皮面作“#”形划痕的角膜植片，用100尼龙缝线将其固定于受体角膜上，将曲霉菌混悬液注入植片与植床间，建立模型. 并在接种后第3，7，10，15日作裂隙灯、角膜刮片、角膜共焦显微镜、角膜组织病理切片检查及培养. 结果：兔眼真菌性角膜炎动物模型成功建立，并经角膜刮片、角膜共焦显微镜、组织病理切片染色检查及培养证实. 共焦显微镜检查早期（接种3 d）见较直、短、分支比较少的高反光的菌丝及孢子，菌丝以斜行、垂直生长方式为主，伴有少量的炎症细胞浸润. 中期（接种7,10 d）共焦显微镜检查除可见高反光的菌丝外还可见大量的炎症细胞（中性粒细胞、巨噬细胞）浸润. 后期（接种15 d）在角膜刮片和组织病理切片检查均未见明显真菌菌丝时，共焦显微镜检查仍可在基质深层见到少量稀疏分布、短小的真菌菌丝. 结论：应用角膜植片成功建立兔曲霉菌性角膜炎模型，共焦显微镜为曲霉菌性角膜炎早期诊断提供了重要的客观依据.

    【关键词】 真菌性角膜炎；曲霉菌；兔;动物模型；角膜共焦显微镜

     0引言

    真菌性角膜炎(fungal keratitis, FK)或称角膜真菌病(keratomycosis)致盲率极高，尤其在西北地区. 近几年来，由于广谱抗生素、糖皮质激素和免疫抑制剂的广泛使用及角膜接触镜佩戴人群的增多，其发病率明显升高［1-4］，在某些地区甚至已跃居感染性角膜疾病的首位［5-6］. 查阅近20年的文献，未发现有通过角膜划痕等方法成功建立真菌性角膜炎模型的报道. 传统的层间注入法和软性接触镜法与真菌性角膜炎的临床病程不同. 本实验我们不使用糖皮质激素，应用角膜植片，建立了一种兔真菌性角膜炎的模型，并应用角膜共焦显微镜对其进行早期诊断. 通过角膜共焦显微镜和病理切片检查对曲霉菌在角膜中的生长特点进行了研究.

    1材料和方法

    1．1材料健康成年有色兔24只，体质量2.0～2.5 kg，雌雄兼用(西安交通大学动物中心). 使用前裂隙灯显微镜检查，证实无眼前节病.

    1．2方法实验前3 d，给予妥布霉素眼液点眼4次/d. 将24只兔随机分成A，B两组，每组12只. A组兔经耳缘静脉空气栓塞处死，无菌条件下摘取眼球，用φ 8 mm环钻制备全厚角膜植片备用. B组兔右眼为模型眼，左眼为对照眼. 皮下注射速眠新Ⅱ 0.2 mL/kg进行全身麻醉，10 g/L地卡因液结膜囊表面麻醉，然后用5 mL/L庆大霉素溶液冲洗右结膜囊，用φ 5 mm环钻在角膜中央划痕，用15号无菌手术刀轻轻刮除划痕中的角膜上皮. 取制备好的角膜植片从内皮面作“#”形划痕，用100尼龙缝线放射状间断缝合8针将其固定于刮除上皮的角膜上. 用注射器抽取0.1 mL曲霉菌混悬液（浓度为106个孢子/L），将其注入右眼的植片与植床角膜层间的中央，结膜囊涂红霉素眼膏，30丝线缝和上下眼睑. 左眼与右眼制作方法相同，植片与植床角膜层间注入0.1 mL生理盐水作对照. 3 d后拆除眼睑缝线，去除角膜植片，观察B组兔角膜情况，妥布霉素眼液点眼,4次/d.分别在菌株接种后的第3，7，10，15日作裂隙灯显微镜查、角膜刮片检查、角膜共焦显微镜（日本NIDEK公司confoscan 3）检查、角膜病理切片检查及培养. 在造模后的第3，7，10，15日分别空气栓塞处死3只兔，沿角膜缘切取角膜、虹膜，按子午线方向剖成两等份. 一份常规行40 g/L甲醛固定、脱水、石蜡包埋、切片、HE（苏木素伊红）染色和PAS（高碘酸希夫）染色，光学显微镜下观察其形态学改变并拍照，一份送培养.

    2结果

    2．1裂隙灯显微镜检查接种真菌的12只兔眼均一次接种成功，在接种的第3日可观察到浅层角膜真菌病变. 结膜囊有黄白色分泌物，结膜充血，病变角膜与健康角膜边界清晰，角膜表面粗糙，轻度隆起，基质混浊水肿，前房无积脓，虹膜无新生血管. 第7日，可见明显溃疡灶并有苔垢样坏死组织附着，溃疡边缘稍隆起毛糙不齐，部分兔周边可见卫星灶，内皮面有内皮斑，角膜弥漫性雾状水肿，前房可见积脓，角膜、虹膜可见新生血管（图1）. 第10日1只兔眼合并细菌感染. 第15日，上皮基本完整，可见瘢痕形成. 对照组3 d时，角膜上皮基本愈合.

    2．2角膜刮片检查3.9 moL/L氢氧化钾湿片法检查，第3, 7日均可查见菌丝、孢子（图2）. 第10，15日未见到菌丝、孢子.

    2．3角膜共焦显微镜检查早期（接种3 d）见较直、短、分支比较少的高反光的菌丝及孢子，菌丝以斜行、垂直生长方式为主，伴有少量的炎症细胞浸润. 中期（接种7，10 d）共焦显微镜检查除可见高反光的菌丝外还可见大量的炎症细胞（中性粒细胞、巨噬细胞）浸润. 后期（接种15 d）可在基质深层见到少量稀疏分布、短小的真菌菌丝（图3）.

      2．4病理切片检查PAS染色早期见少量菌丝平行生长于胶原纤维之间. 中期见大量菌丝斜行、垂直或平行生长基质层，虹膜肿胀，血管高度扩张充血，可见新生血管. 后期未见明显菌丝生长. HE染色早期见基质细胞肿胀，炎性细胞浸润不明显. 中期见基质细胞肿胀明显，大量炎性细胞浸润，以中性粒细胞为多，病灶局部也可见淋巴细胞、巨噬细胞. 后期见基质细胞肿胀减轻，角膜小面形成，胶原纤维排列紊乱，基质层炎性细胞浸润减少（图4,5）.

     2．5培养角膜标本接种于Sabouraud培养皿上，将其置于25℃下培养观察可见曲霉菌菌落如图6.

      3讨论

    目前，国际上通用的动物模型是向兔角膜基质内注射真菌孢子致深层真菌角膜感染的模型［7］. 但这种动物模型与临床病例发病的自然病程不相同. 角膜接触镜法较注射法与临床更为接近，但由于角膜接触镜价格高，且消毒费用高，有其使用局限性［8］. 上述两种方法为确保模型的成功建立，都需要结膜下注射糖皮质激素以增进菌丝对角膜的穿透，而在激素处理的角膜组织中，中性粒细胞不能消化和破坏菌丝，这对实验的结果有影响.

    本实验我们制作动物模型时将供体角膜缝合在受体角膜面上避免了软性接触镜不宜固定的缺点；在供体角膜内皮面作“#”型划痕，利于真菌菌液的保留；只刮除受体角膜中央φ 5 mm的上皮，使病变部位与周围组织对比明显易于观察；在供体角膜和受体角膜面之间接种真菌，则降低了结膜囊内泪液对真菌接种浓度的稀释，提高了真菌细胞与角膜细胞的黏附，减少了泪液中所含有的溶菌酶、免疫球蛋白等抗菌成份对真菌生长的抑制；造模前、中、后分别用抗生素眼膏和眼液可预防细菌感染；缝合眼睑给真菌生长提供了适合的温度和湿度. 我们考虑到模型与临床FK自然病程的相似性，未辅助使用糖皮质激素，但发病率仍然很高，这说明造模成功与否，除了真菌的接种浓度和角膜免疫功能，更重要的是真菌与角膜细胞之间能否进行充分有效的黏附. 在动物模型的建立过程中，注意了严格的无菌手术操作，尽量避免缝合植片时穿透角膜植床，术后应用抗生素预防细菌感染，保证了模型的成功建立. 兔曲霉菌性角膜炎造模后结果显示了FK从浅层逐渐向深层发展的过程，展现了典型FK的表现. 通过角膜刮片检查、角膜共焦显微镜检查和角膜病理切片检查均证实菌丝与孢子的存在，角膜共焦显微镜检查和角膜病理切片检查均证实曲霉菌在兔角膜中以斜形和垂直生长为主. 后期兔角膜逐渐形成斑痕，说明在没有糖皮质基素的作用下中性粒细胞对菌丝具有很强的的消化、破化作用.

    实验结果显示：①共焦显微镜在早期真菌感染的活体角膜上可直观的看到菌丝、孢子及菌丝在角膜基质内的生长方式（如平行、斜性、垂直生长）. 而角膜刮片只能看到菌丝、孢子，无法观察菌丝在角膜基质内的生长方式；病理切片检查虽可观察菌丝在角膜基质内的生长方式，但其标本的制作需经组织切片、固定和特殊染色（如PAS染色）等处理，在此过程中不可避免的带入了人为干扰因素而造成的假象，尤其在角膜只有少量菌丝生长时. 且角膜刮片和病理切片检查均无法在活体角膜进行检查. ②角膜上皮愈合后，角膜刮片检查已不能检出菌丝、孢子，而共焦显微镜检查可在角膜中、深基质层看到菌丝生长和炎症细胞浸润，此时对应的病理切片检查及培养与共焦显微镜检查结果相吻合. ③在造模后期检查时，裂隙灯显微镜检查可见角膜白斑，角膜刮片检查，病理切片染色检查及培养结果均为阴性，而共焦显微镜检查仍可在角膜基质深层见到少量稀疏分布、短小的真菌菌丝及炎症细胞浸润，这对真菌性角膜炎的诊断和药物治疗非常有价值，也为溃疡愈合后仍需继续用药以防复发提供了客观依据.

    【参考文献】

    ［1］ 李美玉. 眼科学［M］.  北京：北京大学医学出版社，2003: 113-114.

    ［2］   陆宏,管怀进. 聚合酶链反应快速诊断真菌性角膜炎［J］. 眼科新进展, 2004,24(4):257-259.

    ［3］   Garg P, Gopinathan U, Choudhary K, et al. Keratomycosis: Clinical and microbiologic experience with dematiaceous fungi［J］. Ophthalmology, 2000, 107(3): 574-580.

    ［4］   Gopinathan U, Ramakrishna T, Willcox M, et al. Enzymatic, clinical and histologic evaluation of corneal tissues in experimental fungal keratitis in rabbits［J］. Exp Eye Res, 2001, 72(4): 433-442.

    ［5］   王丽娅, 张月琴, 王印其，等. 中国三地区真菌性角膜病致病菌种的调查［J］. 中华眼科杂志, 2000, 36(2): 138.

    ［6］   李卉旭, 王丽娅, 董君. 河南地区角膜外伤及其他角膜病病种10年的变迁［J］. 眼外伤职业眼病杂志, 2000, 22(2): 202-203.

    ［7］   Garcia ML, Herreras JM, Dios E, et al. Evaluation of lectin staining in the diagnosis of fungal keratitis in an experimental rabbit model［J］. Mol Vis, 2002, 8: 10-16.

    ［8］  ODay DM, Head WS, Robinson RD, et al. Contact lensinduced infection:A new model of Candida albicans keratitis［J］. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1999, 40(7): 1607-1611.