1．2．3　细胞数量检测

　　细胞培养过程中，每日用倒置显微镜观察各孔细胞增殖情况。药物作用48h去除培养上清后，采用0.1%胰蛋白酶及0.01%EDTA消化后，2%台盼兰染色行活细胞计数，以确定各孔存活细胞数量是否一致。

　　2结果

　　2．1　细胞生长情况

　　各培养时期，加药物孔和未加药物孔细胞生长增殖情况相似；药物作用48 h后，各孔细胞已达基本融合状态。2%台盼兰染色检查各孔活细胞数量相似。
 
　　2．2　Verapamil对培养角膜基质细胞分泌TGF-β1的含量

　　Verapamil浓度为2.5μg／ml，作用48h，培养上清中TGF-β1含量较对照组降低，但经统计学处理，无明显差异(P＜0．05)；浓度为5μg／ml和10μg／ml时，培养上清中TGF-β1含量明显低于对照组，经统计学处理，均有显著性差异(P＜0．05)，且Verapamil浓度越高，培养上清中TGF-β1含量越少(见图1)。 

　　图1　Verapamil作用48h后培养上清中TGF-β1含量

　　Fig．1　The concentration of TGF-β1 in supernatant after verapamil exposure for 48h

　　3讨论

　　3．1　TGF-β1在角膜伤口愈合中的作用

　　TGF-β1是一种多功能调节肽，它能促进或抑制细胞增殖、分化和细胞的功能。角膜上皮细胞和基质细胞中均有TGF-β1和TGF-βRⅡ mRNA表达，因此TGF-β1可以通过自分泌和旁分泌方式调节角膜上皮细胞和基质细胞增殖、分化的功能［3］。TGF-β1的作用主要是与其调节细胞外基质(extracellular　matrix，ECM)，特别是调节Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型胶原、纤维连接蛋白和氨基葡萄糖(GAG)的形成有关。其作用机制有［3］：(1)增加ECM主要成分的合成；(2)降低ECM的蛋白降解；(3)调节结合素(integrin)受体的合成。TGF-β1通过调节角膜基质细胞产生ECM而促进角膜伤口的愈合。TGF-β1还通过调节其它细胞因子而间接调节着角膜基质细胞的增殖和分化，Hongo等［4］报道TGF-β1能促进培养兔角膜基质细胞高亲合型表皮生长因子受体(epidermal　growth　factor　receptor，EGFR)的表达，因此增加细胞对TGF-α和EGF的反应敏感性而间接调节伤口的愈合；Leof等［5］报道TGF-β1通过促进血小板源性生长因子(PDGF)基因的表达而间接促进成纤维细胞的增殖。
 
　　3．2　Verapamil对角膜基质细胞分泌TGF-β1的影响

　　Verapamil为一经典的钙离子通道阻滞剂，最近研究证实它具有显著抑制眼内成纤维细胞增殖的作用，局部应用0.125%和0.25％Verapamil无明显毒副作用［1，6］，越来越受到眼科界的青睐。我们通过实验发现Verapamil浓度＞10～1000μg／ml时，对培养兔角膜基质细胞具有明显抑制作用［7］，为了对其作用机制有所了解，本实验着重观察了Verapamil对培养角膜基质细胞分泌TGF-β1的影响。由于Verapamil浓度≤10μg／ml时，对角膜基质细胞无明显抑制作用，为了排除由于存活细胞数量的减少而致细胞分泌入培养上清中TGF-β1减少，影响实验结果，故本实验选用Verapamil药物浓度为2.5、5、10μg／ml；同时培养结束后进行活细胞计数，进一步证实各药物浓度作用孔存活细胞数相似，更加增加了实验的可比性。本实验结果发现Verapamil能明显减少培养角膜基质细胞分泌TGF-β1，因此可以推断Verapamil抑制角膜基质细胞增殖的作用部分是由于它抑制细胞分泌TGF-β1，进而调节基质细胞增殖、分化和功能。Verapamil廉价、易得，局部应用无明显毒副作用，因而它可望成为一种调节角膜伤口愈合的药物，特别是在减轻PRK术后haze形成方面具有很好的应用前景，其临床应用尚待进一步研究。

　　1，Richter D，Hatvani I，Toth A．Inhibition of proliferative intraocular tissue growth in vitro with verapamil．Klin Monatsbl Augenheilkd，1993，203（3）∶206

　　2，钟一声，王康孙，石海云．猴、兔角膜细胞成分原代培养的实验研究．眼科研究，1999，17(3)∶191

　　3，钟一声．转化生长因子-β对角膜伤口愈合的调节．眼科，1998，7(4)∶244

　　4，Hongo M，Itoi M，Yamaguchi N，et al．Distribution of epidermal growth factor（ECF）receptors in rabbit corneal epithelial cells，keratocytes and endothelial cells and the changes induces by transforming growth factor-β1．Exp Eye Res，1992，5，4∶9

　　5Leof EB，Proper JA，Goustin AS，et al．Induction of c-sis mRNA and activity similar to PDGF by TGF-β1∶a proposed model for indirect mitogenesis involving autocrine activity．Proc Natl Acad Sci USA，1986，83∶2453

　　6，Netland PA，Grosskreutz CL，Feke GT，et al．Color doppler ultrasound analysis of ocular circulation after topical calcium channel blocker．Am J Ophthalmol，1995，119∶694

　　7，钟一声，王康孙，张景迎．Verapamil对角膜基质细胞影响的研究．中国实用眼科杂志，1999，17(7)∶399
 
　　收稿：1999－01－09

　　修回：1999－10－03

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