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兔视神经损伤后视网膜神经节细胞MDA/SOD的变化

http://www.cnophol.com 2009-8-25 13:56:05 中华眼科在线

  【摘要】  目的:观察兔视神经损伤后视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell,RGC)丙二醛(malondialdehyde,MDA)/超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)的变化。

  方法:选用新西兰白兔32只,分为对照组和损伤组,损伤组再根据损伤后不同时间分为3,7,14d组,每组8只16眼。采用硫代戊巴比妥酸法和黄嘌呤氧化法分别测定视网膜MDA/SOD含量。

  结果:损伤实验组MDA含量分别为 5.95±0.78,7.67±0.64 和8.29±1.02 μmol/g,均明显高于正常对照组(3.82±0.54μmol/g);实验各组SOD含量分别为510±44 ,415±29和398±36μkat/g,均明显低于正常对照组(727±52μkat/g)。

  结论:自由基代谢在兔视神经损伤后RGC凋亡中起着重要作用,MDA/SOD含量测定在RGC凋亡的研究中有一定的意义。

  【关键词】  视神经损伤 视网膜神经节细胞 丙二醛 超氧化物歧化酶 凋亡

  0引言

  视神经损伤后视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell,RGC)发生继发性死亡,从而导致严重视功能障碍甚至永久失明。凋亡是RGC继发性死亡的一种重要形式,其中自由基扮演着重要角色。丙二醛(malondialdehyde,MDA)是自由基脂质过氧化反应最终代谢产物,测定MDA的含量可以反映机体内脂质过氧化的程度,间接反映出自由基对组织细胞的损伤程度;视网膜超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是自由基清除剂,测定SOD的含量可以反映自由基的清除能力。我们采用兔视神经夹闭伤模型,观察MDA/SOD的含量变化,以期明确自由基代谢在RGC凋亡中的作用。

  1 材料和方法

  1.1材料

  健康新西兰白兔32只,雌雄不限,体质量2.5~3.0kg,外眼和眼底检查正常。随机分为正常对照组和损伤实验组,损伤实验组再根据损伤后不同时间分为3,7,14d组,每组8只16眼。戊巴比妥钠按30mg/kg耳缘静脉注射麻醉。从兔眼颞侧暴露视神经,用带凹槽血管夹于球后3mm处夹闭视神经15s,制作兔视神经损伤模型。兔麻醉后摘除眼球,于冰台上剥离视网膜,称重后置标本于1mL的玻璃匀浆器中,加入生理盐水,于冰上匀浆5min移入离心管内离心15min(1500r/min)。取上清液,待检。

  1.2方法

  分别采用硫代戊巴比妥酸法和黄嘌呤氧化法测定MDA/SOD。自由基脂质过氧化反应最终代谢产物MDA可与硫代戊巴比妥酸(TBA)缩合形成红色产物,在532nm处有最大吸收峰,根据吸光度计算MDA含量(单位:μmol/g)。SOD对阴离子自由基有专一抑制作用,后者与氧化羟胺形成亚硝酸盐,在显色剂作用下呈紫红色,可通过分光光度仪测其吸光度减少的情况计算SOD含量(单位:μkat/g)。MDA/SOD测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供,按试剂盒说明测定MDA和SOD。

  统计学处理:采用方差分析检验,应用SPSS 10. 0 软件包进行处理,取α=0.05为检验标准。

  2结果
   
  正常对照组视网膜MDA含量3.82±0.54μmol/g。损伤实验组3,7,14d时视网膜MDA含量分别为5.95±0.78,7.67±0.64和8.29±1.02μmol/g,各组MDA含量均明显高于正常对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。正常对照组视网膜SOD含量727±52μkat/g。损伤实验组3,7,14d时视网膜SOD含量分别为510±44,415±29和398±36μkat/g,各组SOD含量均明显低于正常对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。

  3讨论
   
  视神经损伤后关于RGC凋亡的研究逐渐深入,常规的凋亡检测方法包括光镜、电镜下形态学观察、DNA凝胶电泳、TUNEL染色等,我们近期亦报道了线粒体跨膜电位在凋亡早期检测中的应用[1]。我们观察视网膜神经节细胞MDA/SOD在兔视神经损伤后的变化,以期阐述线粒体自由基代谢在RGC凋亡中的作用。众所周知,自由基不仅是体内最重要的凋亡诱因[2],而且还可以通过引发脂质过氧化反应造成细胞损伤。其机制包括损伤细胞脂膜,导致细胞内Ca2+浓度升高,激活Ca2+,Mg2+依赖性核酸内切酶;直接攻击DNA分子;识别并水解对氧化还原反应敏感的转录因子(如NFkB)和抑制性蛋白等。MDA是自由基脂质过氧化反应最终代谢产物,测定MDA的含量可以反映机体内脂质过氧化的程度,间接反映出自由基对组织细胞的损伤程度;SOD是自由基清除剂,测定SOD的含量可以反映自由基的清除能力[3,4]。我们采用兔视神经夹闭伤模型,在实验后3,7d和14d分别测定MDA/SOD的含量,实验结果表明,兔视神经损伤后3,7d和14d视网膜组织中MDA含量逐渐升高,而SOD含量逐渐降低,两者较正常对照组均有显著性差异(P<0.05)。结果说明在视神经损伤后RGC内SOD不断被消耗,致使自由基不断堆积,导致细胞出现不可逆损伤[5]。
   
  自由基对视网膜的损伤可能主要是以下3个方面:1)视网膜细胞由高度集中的不饱和脂质构成。视神经损伤后,大量自由基攻击胞膜,诱发脂质过氧化而导致脂质自由基与MDA积聚。MDA可抑制酶的活性,或充当交联剂与核蛋白质所形成各种各样交联,从而引起膜受体、膜蛋白酶和离子通道的功能障碍,从而使ATP生成减少,细胞内Ca2+超负荷[6]。Barilan等[7]报道视神经损伤后膜脂质过氧化将催化花生四烯酸代谢形成血栓素A2(TXA2)、前列环素(PGI2)等多种活性物质,造成视神经血管收缩,痉挛和闭塞,加重组织缺血缺氧,引起一系列继发性损伤。2)自由基造成蛋白质的多种氧化损伤,从而导致大量酶的失活[8]。3)自由基与脂质、蛋白质的反应造成多种大量生物膜损伤,破坏细胞膜的动态平衡,引起细胞内物质释放,线粒体膜受损引起肿胀,造成能量生成障碍,溶酶体膜受损将释放出水解酶损伤组织,甚至引起细胞的死亡。
   
  实验证明自由基代谢变化在兔视神经损伤后RGC凋亡中有着重要作用,MDA/SOD含量测定在RGC凋亡的研究中也有着一定的意义,但在视神经损伤后如何及时、有效地通过抗氧化作用对抗自由基的损伤,并抑制外伤后因氧化磷酸化过程中电子漏出增加造成的自由基产生过多,使细胞膜破坏减少,血管活性物质减少,减轻炎症反应,从而减轻自由基对视网膜细胞造成的原发和继发性损伤,尚需进一步研究。

  【参考文献】

  1曹文捷,蜂寸光,翁晓燕,等.兔视神经损伤后视网膜神经节细胞线粒体跨膜电位的变化观察.眼科新进展 2007;27(5):341343

  2 Levin LA, Schlamo CL, Spieldoch RL. Identification of the bcl2 family of genes in the rat retinal. Invest Ophthalmol Vis Sci 1997;38(12):25452553

  3谢佩玉,张晓梅,松仓诚,等.高糖条件下糖康乐对兔视网膜色素上皮细胞超氧化物歧化酶表达的影响.国际眼科杂志,2007;7(6):15841586

  4 Chang JR, Xu DQ. Effects of formaldehyde on the activity of superoxide dismutases and glutathione peroxidase and the concentration of malondialdehyde. WeiSheng YanJiu 2006;35(5):653655

  5徐西彬,陈耀星,王子旭,等.应用视网膜铺片和神经元逆行标记术测定神经节细胞密度分布.国际眼科杂志 2007;7(3):654657

  4禹海,叶剑,贺翔鸽.兔额部撞击伤后视网膜LPO, NO变化的实验研究.中国实用眼科杂志 2002;20(11):865867

  7 Barilan A, Naveh N, Weissman C, et al. Prostaglandin E2 changes in the retina and optic nerve of an eye with injury optic nerve. Neuroscience 1991;45(1):221225

(来源:互联网)(责编:xhhdm)

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