【摘要】目的：OVA小鼠前房抗原特异性CD8+T细胞的数量和功能变化是否与CD40单克隆抗体有关。方法：OVA前房注射的同时，腹腔给与小鼠CD40单克隆抗体，第7d给予足底皮下免疫OVA和CFA，第14d，取脾脏制备单细胞悬液，用流式检测和细胞内细胞因子染色（IFNγ）进行评价CD8+T细胞的数量和功能有无变化。同时用不给与ip CD40单克隆抗体的ACAID小鼠作为阴性对照组。结果：试验组和阴性对照组脾脏CD8+T细胞数量和分泌IFNγ无显著性差异。结论：ACAID中，CD8+T细胞介导的细胞毒性反应（CTL反应）可能为CD4+T细胞非依赖性。
【关键词】 ACAID； CD8+T细胞；CD40单克隆抗体
Study on the association between CD40 mAb and CD8+T cells in the spleen of ACAID mice
YaLin Ren, Chong Wang, DongMei Cui
Foundadion item: Zhongshan Science and Technology Fund (NO. 20071C015)
1Sun Yatsen University, Guangzhou 510060, Guangdong Province, China; 2Department of Ophthalmology, Zhongshan Peoples Hospital, Zhongshan 528403, Guangdong Province, China; 3Nanshan Women and Children Healthcare Hospital, Shenzhen 518100, Guangdong Province, China; 4Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yatsen University Guangzhou 510060, Guangdong Province, China
Correspondence to: YaLin Ren. Department of Ophthalmology, Zhongshan Peoples Hospital, Zhongshan 528403, Guangdong Province, China. [email protected]
AbstractAIM: To evaluate the the relationship between CD40 mAb and CD8+T cells in the spleen of anterior chamber associated immune deviation (ACAID) mice. METHODS: The mice were injected into anterior chamber with ovabumin (OVA) and given intraperitoneal immunization CD40 mAb at the same time in experimental group. On day 7, these mice were immunized subcutaneously with antigens and complete Freunds adjuvant (CFA). On day 14, the spleen was extracted and the single cell suspension was made. With flow cytometry (FCM) and intracellular IFNγ staining, the number and function of CD8+T cells were reevaluated. The ACAID mice without intraperitoneal immunization CD40mAb were used as negative control groups.RESULTS: There was no significant difference in the number of CD8+ T cells and IFNγ secretion between experimental group and negative control group.CONCLUSION: The CTL reaction in ACAID might be CD4+T cells independent.
KEYWORDS: ACAID; CD8+T cells; CD40 mAb
0引言
前房相关免疫偏离（ACAID）是指抗原置入前房后所诱发的一种免疫偏离现象[1]。它是机体防御眼部特异性和非特异性炎症的一种重要机制。ACAID中CD8+T细胞介导的细胞毒性反应受抑制是其特点之一，最近研究表明[2,3]，CD8+T细胞正常功能的维持或增强可以通过给与正常小鼠ip CD40单克隆抗体实现；我们已知IFNγ是CD8+T细胞分泌的一种重要的抑菌性细胞因子，IFNγ分泌量的多少在一定程度上代表了CD8+T细胞的功能。因此本研究的主要目的是通过给小鼠ip CD40单克隆抗体，观察ACAID小鼠脾脏CD8+T细胞数量和功能的变化。
1材料和方法
1.1材料
C57BL/6小鼠（SPF 级）（广州中医药大学动物实验中心提供）12只，雌性，6～8wk龄，体质量20～26g。将小鼠随机分组：（1）ACAID组，4只；（2）ACAID组小鼠前房注射同时给与ip CD40单克隆抗体，4只；（3）阳性对照组为只接受足底注射OVA和CFA组，该组只在评价ACAID是否形成中做对照，共4只。卵白蛋白(OVA)和完全弗氏佐剂(CFA)购自美国Sigma公司， FITC标记的抗小鼠CD3, PEcy5标记的抗小鼠CD8a和PE标记的抗小鼠IFNγ均购自eBioscience公司（美国），RPMI1640培养液购自Gibco公司（U.S.A.），CD40单克隆抗体购自eBioscience公司（美国）以及BD公司（美国）的流式分析仪。
1.2方法
1.2.1 ACAID的常规诱导[4]
采用乙醚吸入法麻醉小鼠，用托品酰胺散瞳，然后在手术显微镜下，用玻璃微量注射针于角巩膜缘前0.5mm处刺入前房，将5μL(100μg)OVA溶液(20g/L)注入小鼠前房。实验组小鼠前房注射OVA后第7d，将250μg（100μL）OVA（2.5g/L）溶液与等体积CFA充分研磨成乳剂，总体积为0.2mL，sc于小鼠右后足垫内免疫动物。免疫动物1wk后，用工程游标卡尺（精确度为0.01mm）测量实验组和对照组双耳廓厚度，然后于小鼠左耳廓皮内注射400μg（20μL）（20g/L）OVA溶液，右耳廓皮内注射相同剂量的无菌PBS溶液。24h后，再用工程游标卡尺测量双耳廓厚度，按照下述公式计算耳廓肿胀数值。未行前述任何处理的小鼠作为阴性对照组，阳性对照组为只进行耳廓注射不进行前房注射的小鼠。公式为：迟发型超敏反应耳廓肿胀数值=（24h左耳廓厚度值0h左耳廓厚度值）（24h右耳廓厚度值0h右耳廓厚度值）（mm）。
1.2.2流式检测CD8+T细胞数量
在前房注射抗原后第14d，对（1）（2）组小鼠断髓处死，无菌取出脾脏，制备单细胞悬液，取适量细胞染色进行流式检测。用CD3+CD8+设门，并计数50.000个细胞分析各组CD8+T细胞在T细胞中的比例。
1.2.3细胞内细胞因子IFNγ染色
同样在前房注射抗原后第14d，对（1）（2）组小鼠断髓处死，无菌取出脾脏，制备单细胞悬液。按照试剂盒说明书进行，即对适量细胞进行细胞刺激、固定破膜、染色后流式检测。用CD3+CD8+设门，分析各组中IFNγ+CD8+T细胞在CD8+T细胞中的比例。
统计学处理：流式分析结果用SPSS 11.0统计软件t检验进行分析，以P<0.05为统计学显著性差异判定标准。表1OVA诱导的小鼠耳廓肿胀反应（略）
2结果
2.1迟发型超敏反应
（DTH）测量结果发现，前房注射OVA抗原的小鼠耳廓肿胀程度远远小于阳性对照组（表1），说明ACAID形成。
2.2 CD8+T细胞的数量
流式结果(图1)发现，在ACAID组，小鼠脾脏中CD8+T细胞占T细胞总量的40%左右（Data.006），和同时接受ip CD40单克隆抗体组无显著统计学差异（Data.004）。
2.3 CD8+T细胞分泌IFNγ的量
流式结果(图2)发现，在ACAID组，小鼠脾脏中IFNγ+CD8+T细胞占CD8+T细胞的1%左右（Data.006），和同时接受ip CD40单克隆抗体组无显著统计学差异（Data.004）。
3讨论
在免疫应答过程中，T细胞上的CD40L分子与抗原提呈细胞上的CD40分子结合，为T细胞的活化提供共刺激信号。近来的研究发现[2,3]，CD8+T细胞正常功能的维持，同时依赖于CD4+T细胞提供的辅助作用，而这种辅助作用正是通过抗原提呈细胞上的CD40与CD4+T细胞上表达的CD40L的相互作用完成的。研究发现，在一些慢性病毒感染性疾病[57]，如LCMV（lymphocytic choriomeningitis virus infection）模型中，人们首先通过CD4基因敲除鼠作为研究模型发现，CD8+T细胞的杀伤功能消失，然后人们通过对野生小鼠进行抗体阻断CD4后，发现CD8+T细胞的杀伤功能也几乎消失，而在正常小鼠的LCMV模型中，CD8+T细胞清除病毒的功能是正常的；因此人们认为在某些感染性疾病中，CD8+T细胞正常功能的维持需要CD4+T细胞的存在和对CD8+T细胞的正常辅助作用。研究表明[8]，在CD4敲除鼠给与ip CD40单克隆抗体后，CD8+T细胞的杀伤功能可以恢复，或者在给予正常小鼠ip CD40单克隆抗体后，CD8+T细胞的杀伤功能可以加强。因此，CD40单克隆抗体在一定程度上可以替代CD4+T细胞对CD8+T细胞的辅助作用。但是并非所有的CD8+T细胞介导的细胞毒反应（CTL）均依靠CD4+T细胞的依赖作用，在某些疾病，如急性病毒感染性疾病中，CTL反应不依赖于CD4+T细胞的辅助作用。因此，CTL反应有CD4依赖性和非依赖性两种反应[9]。
在本试验中，结果表明， ACAID组CD8+T细胞的数量和分泌IFNγ的能力较同时接受ip CD40单克隆抗体组都没有改变。因此，在ACAID中抗原特异性CD8+T细胞介导的CTL反应可能不依赖于CD4+T细胞的辅助作用。
【参考文献】
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3 Bennett SRM, Carbone FR, Karamalis F. Help for cytotoxicTcell responses is mediated by CD40 signalling. Nature1998;393:478480
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8 Lefrancois L, Altman JD, Williams K, et al. Soluble antigen and CD40 triggering are sufficient to induce primary and memory cytotoxic T cell. JImmunol2000;164:725732
9 Kosiewicz MM, Alard P, Streilein JW. Alterations in cytokine production following intraocular injection of soluble protein antigen: impairment in IFN and Induction of TGFβ and IL4 production. J Immunol1998;16:53825390 |
