【摘要】 目的： 观探讨大鼠视网膜缺血再灌注损伤后p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）的磷酸化及其意义. 方法： 采用升高眼内压的方法，制作实验性视网膜缺血再灌注大鼠模型. 将30只Wistar大鼠随机分为正常组（n=6）和缺血再灌注组（n=24），其中缺血再灌注组又分为再灌注后2，12，24，72 h等4个时间段（每时间段6只）. 应用Western Blot法检测视网膜组织中p38 MAPK及磷酸化p38 MAPK （pp38 MAPK）蛋白的表达变化. 结果： p38 MAPK在缺血再灌注组各时间点的视网膜组织内的表达保持相对恒定，与正常对照组相比无统计学上的变化（P>0.05）. pp38 MAPK的表达水平在缺血再灌注组12 h时即有明显升高，24 h时达到高峰，72 h时仍维持较高的表达水平，与正常对照组相比有统计学著差异（P<0.01）. 结论： p38 MAPK信号通路的激活可能与缺血再灌注所造成的视网膜损伤有密切关系.
【关键词】 视网膜；再灌注损伤；p38丝裂原活化蛋白激酶类；印迹法，蛋白质；大鼠
0引言
视网膜缺血再灌注（retina ischemiareperfusion injury）损伤主要发生在视网膜动静脉阻塞、未成熟的视网膜病变、糖尿病性视网膜病变等视网膜血管阻塞所致的缺血性疾病中，它们均可造成不同程度的视网膜缺血. 在缺血再通后，视网膜反而受到更为严重的损伤，造成视功能下降［1- 2］. 因此，加强对视网膜缺血再灌注损伤机制的研究是非常重要的. 目前视网膜缺血再灌注损伤的机制尚未完全阐明，本实验通过建立大鼠的视网膜缺血再灌注损伤模型，观察丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase, MAPK）家族成员之一的p38 MAPK蛋白在缺血再灌视网膜中的表达以及其磷酸化的时相变化，探索p38 MAPK在视网膜缺血再灌注损伤中的可能作用，为临床治疗视网膜缺血再灌注损伤类疾病提供理论依据.
1材料和方法
1.1材料成年健康Wistar大鼠30只，第四军医大学实验动物中心提供. 雌雄不拘，体质量270～300 g，室温环境饲养. 小鼠抗p38 MAPK及小鼠抗磷酸化p38 MAPK (pp38 MAPK)单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；山羊抗βactin多克隆抗体购自美国Chemicon公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗小鼠或山羊二抗购自Chemicon公司；ECL化学发光试剂盒、PVDF膜购及Hyperfilm胶片自美国Amersham公司；蛋白质提取及浓度测定试剂盒购于美国BioRad公司.
1.2方法
1.2.1视网膜缺血再灌注模型的建立动物随机分成两组：正常对照组（6只）和缺血再灌注组（24只）. 缺血再灌注组又分为再灌注后2, 12, 24, 72 h等4个时间段（每时间段6只大鼠）. 以前房灌注升高眼压的方法制备大鼠视网膜缺血. 再灌注损伤模型，具体方法为： 大鼠以水合氯醛麻醉(400 mg/kg)，将生理盐水瓶连接输液器，升高输液瓶至于大鼠眼垂直距离为150 cm左右处，灌注压力达到110 mm Hg (14.63 kPa). 将连接输液器的7号头皮针自大鼠颞侧角膜缘穿刺入前房，手术显微镜直视下可见灌注压平衡后，视网膜苍白水肿，表明视网膜中央动脉供血已被完全阻断. 60 min后降低液瓶高度至27 cm以下(<20 mm Hg)，此时可见视网膜变红，表明视网膜血管重新开放，已形成再灌注. 此时拔出前房灌注针头，再灌注计时开始.
1.2.2视网膜内p38MAPK和pp38MAPKA的检测① 视网膜组织蛋白质的提取：正常对照组动物及再灌注后第2, 12, 24, 72 h的动物以水合氯醛麻醉，快速取双侧眼球，分离出视网膜，液氮中速冻. 加入裂解缓冲液（0.15 mol/L NaCl, 0.05 mol/L Tris, 0.1 mg/L SDS，0.1 mg/L苯甲磺酰氟，1 μg/L抑蛋白酶肽，1 mg/L NP40）. 匀浆，冰上裂解30 min，4℃ 12000 g离心20 min，吸上清，-70℃保存. ② 蛋白质SDSPAGE及电转印：用蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度，取20 μg蛋白，进行125 g/L的聚丙烯酰胺凝胶电泳. 电泳结束后，用BioRad半干电转移装置将蛋白质转印至PVDF膜，用含50 mg/L脱脂奶粉的PBST溶液（0.2 mmol/L PBS，0.02 g/L吐温20）封闭，室温2 h. ③ Western Blot检测：分别加入p38 MAPK（1∶2000）， pp38 MAPK（1∶2500）和βactin（1∶5000）抗体，室温过夜. PBST洗膜，10 min×3次，再加入HRP结合的羊抗小鼠IgG（1∶5000）或驴抗山羊IgG（1∶5000），室温孵育2 h. PBST洗膜后，加入ECL显色剂，置暗室曝光. 曝光后的胶片进行显影、定影，用UVP凝胶成像系统对胶片上的条带进行扫描分析.
统计学处理：用Labworks软件对各阳性条带的密度进行测量，测得的p38 MAPK和pp38 MAPK阳性条带的密度与相应的βactin条带密度的比值作为其蛋白的相对表达量，采用SPSS10.1分析软件对实验数据进行方差分析以及两两比较的Dunnettt检验.
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