作者：彭惠,洪苏玲,陶永贤,彭彦,姜蓉
Expression of matrix metalloproteinase2 mRNA in retina of diabetic hamster
【Abstract】 AIM: To explore the role of matrix metalloproteinase2 (MMP2) in the development of diabetic retinopathy (DR). METHODS: Hamsters were used to establish diabetic models by Streptozotocin (40 mg/kg). Total RNA of retina was collected. The expression of MMP2 mRNA in retina were observed by using semiquantitative RTPCR. Morphologic characteristics and changes of retina was observed by HE staining. The changes of TG, TC were tested serologically and insulin was tested by electrochemiluminescence. RESULTS: Diabetic hamster displayed not only hyperglycaemia, but also hyperlipemia. The expression of MMP2 mRNA in retina showed a increasing tendency. CONCLUSION: MMP2 may contribute to the pathogenesis of DR.
【Keywords】 diabetic retinopathy；RTPCR；matrix metalloproteinases；diabetic hamster
【摘要】 目的：探讨基质金属蛋白酶(MMP2)在糖尿病视网膜病变(DR)发生发展中的作用及其机制. 方法：用链脲佐菌素（STZ）诱导苍鼠糖尿病模型，提取视网膜中总RNA，半定量RTPCR观察视网膜中MMP2 mRNA表达情况，HE染色观察光镜下视网膜的形态特征及变化，血清学检测苍鼠血清甘油三酯(TG)，总胆固醇(TC)和电化学发光法检测胰岛素水平等变化. 结果：糖尿病苍鼠不仅表现为高血糖,还表现为高TG血症. 视网膜中MMP2 mRNA表达呈升高趋势, 与正常对照组相比于造模后16 wk末时即差异具有统计学意义(P<0.05). 结论：此为研究基质金属蛋白酶参与DR的发病机制提供了依据.
【关键词】 糖尿病视网膜病变；RTPCR；基质金属蛋白酶；糖尿病苍鼠
0引言
糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy, DR）的发生机制至今尚未完全阐明，细胞外基质（ECM，包括基底膜）的代谢异常被认为是发生DR时血管功能障碍的病理学基础. 基质金属蛋白酶（MMPs）是一类Zn2+依赖的蛋白水解酶，参与ECM的降解代谢. 本研究应用链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）诱导苍鼠糖尿病模型，观察视网膜中MMP2表达情况，为研究其在DR中的作用提供依据.
1材料和方法
1.1STZ诱导苍鼠糖尿病模型8 wk雄性仓鼠,体质量110～130 g,禁食12 h后,腹腔注射STZ溶液40 mg/kg体质量,连续3 d. 德国拜耳公司快速血糖仪测定尾尖血空服血糖(氧化酶试纸法),血糖稳定7 d后,选用血糖>13.5 mmol/L的仓鼠为糖尿病(DM)仓鼠(13只). 实验持续16 wk,每2 wk测仓鼠体质量,血糖. 正常对照组(NC)仓鼠(10只)予腹腔注射等体积柠檬酸钠柠檬酸缓冲液.
1.2石蜡切片HE染色与观察取眼球固定后标本常规脱水，石蜡包埋，做5 μm连续切片，按HE染色常规操作进行，观察每组视网膜在光镜下的形态特征及其变化.
1.3血清学检测全自动生化分析仪测定仓鼠静脉血血清甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC). 电化学发光法检测胰岛素水平.
1.4视网膜中总RNA制备实验动物于16 wk在测体质量及空腹血糖后摘除眼球，剥离视网膜，液氮保存. Trizol（美国Invitrogen公司）提取总RNA，测定纯度和含量，10 g/L甲醛变性凝胶电泳测其完整性.
1.5半定量RTPCR总RNA 5 μg用逆转录酶SuperscriptTM11RT（美国Invitrogen公司）合成cDNA第一链:MMP2上游和下游引物为5′ TGACCTTGACCAGAACAC 3′和5′ GGCATCATCCACTGTCTC 3′;β肌动蛋白上游和下游引物为5′ GTGGGGCGCCCCGGCACCA 3′和5′ CTCCTTAATGTCACGCACGATTT 3′.
扩增条件为：MMP2 94℃预变性5 min，94℃ 1 min, 49℃ 50 s, 72℃ 45 s共27个循环，72℃延伸5 min，扩增产物长度为169 bp；β肌动蛋白引物在扩增5个循环后加入，长度为500 bp. 15 g/L琼脂糖凝胶电泳，BioRAD凝胶成像系统照相，SXimage软件分析，MMP2 mRNA 含量用MMP2与β肌动蛋白吸光度×面积的比值表示.
统计学处理：本研究数据以x±s表示，采用两样本均数比较的t检验进行统计学分析.
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