【摘要】 目的 探讨氯沙坦对糖尿病(DM)大鼠肾组织细胞外基质转化生长因子β1(TGFβ1)、纤维连接蛋白(FN)和Ⅳ型胶原(ColⅣ)mRNA表达的影响。方法 48只大鼠分为对照组;DM组：链脲佐菌素(STZ)70 mg/kg腹腔注射;氯沙坦干预组(氯沙坦组)：氯沙坦30 mg·kg-1·d-1灌胃，检测各组在2、4、8 w的尿白蛋白及肾脏肥大指数;采用半定量逆转录聚合酶链反应(RTPCR)技术检测TGFβ1、FN、ColⅣ mRNA表达。结果 DM组和氯沙坦组中TGFβ1，ColⅣ和FN mRNA的表达显著高于对照组(均P<0.01);氯沙坦组TGFβ1 mRNA在4、8 w均低于DM组(P<0.05或P<0.01);氯沙坦组ColⅣ在4、8 w时均低于DM组(均P<0.05);氯沙坦组UAER在4、8 w时均低于DM组(均P<0.05);氯沙坦组肾肥大指数在各时间段均略低于DM组(均P>0.05)。结论 氯沙坦具有抑制DM大鼠肾组织细胞外基质基因表达的作用。
【关键词】 Ⅳ型胶原;糖尿病肾病;转化生长因子β1;氯沙坦;纤维连接蛋白
糖尿病肾病(DN)是糖尿病(DM)主要的微血管并发症之一，如何阻止与延缓其发生、发展，已成为DM研究的重点。细胞因子在DN发病中的作用越来越得到人们的关注。为此本研究利用血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1)拮抗剂氯沙坦对DM大鼠肾组织转化生长因子β1(TGFβ1)、纤维连接蛋白(FN)和Ⅳ型胶原(COLⅣ)mRNA表达的作用进行研究，以期进一步探讨其可能的作用机制。
1 材料与方法
1.1 动物分组和模型建立 SD大鼠30只(体重160～180 g，雌雄各半)，购自郑州大学医学实验动物中心，随机分为3组，每组10只：正常对照组(对照组);DM组：链脲佐菌素(STZ，Sigma公司)70 mg/kg腹腔注射，48 h后尾静脉采血测定血糖≥16.7 mmol/L者确定为DM大鼠;氯沙坦干预组(氯沙坦组)：DM模型确定后第2天给予氯沙坦30 mg·kg-1·d-1灌胃，对照组和DM组给予等量的生理盐水灌胃，实验期间所有大鼠自由饮水，标准饲料不使用胰岛素和其他降糖药。
1.2 标本采集和检测 于实验第2、4、8 w各组随机取10只大鼠，用代谢笼收集24 h尿液，采用免疫散射比浊法检测尿白蛋白(试剂北京九强生物工程公司)。之后禁食10 h，20%乌拉坦麻醉后由腹主动脉采血，3 000 r/min离心5 min分离血清，用美国BeckmanCoulter公司CX9全自动生化分析仪检测血糖、尿素氮、肌酐。肾脏肥大指数以肾重/体重(g/kg)比值表示。留取肾脏标本用生理盐水漂洗后，保存于液氮中待提取总RNA。
1.3 引物设计和RTPCR检测 取肾皮质100 mg加液氮研碎后，用Trizol(美国Gibco公司)提取总RNA。根据A260/A280值计算RNA的浓度和纯度。TGFβ1 mRNA上游引物为：5′AATACGTCAGACATTCGGGAAGCA3′，下游引物为：5′TCCACCACCCTGTTGCTGAC3′，扩增产物为498 bp，GAPDH上游引物为：5′ACCACAGTCCATGCCATCTA3′，下游引物为：5′TCCACCACCCTGTTGCTGAC3′,扩增产物为498 bp;Col Ⅳ mRNA上游引物为：5′GTGCGGTTTGTGAAGCACCG3′，下游引物为：5′GTTCTTCTCATGCACACTTC3′，扩增产物为363 bp;GAPDH上游引物为：5′CATGGTCTACATGTTCCAGT3′，下游引物为：5′GGCTAAGCAGTTGGTGGTGC3′，扩增产物为505 bp;FN mRNA上游引物为：5′CAGTTTGTGGAAGTGACCGA3′，下游引物为：5′TGGAGGTTAGTGGGAGCATA3′，扩增产物为272 bp，GAPDH上游引物为：5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′，下游引物为：5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA3′，扩增产物为349 bp(以上
引物有上海生物工程公司合成)。PCR按逆转录二步法试剂盒(Invitrogen)进行操作，反应参数为：94℃ 60 s，58℃ 60 s，72℃ 120 s，共30个循环，产物用2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，并在UVP凝胶成像系统分析电泳带灰度。
1.4 统计学处理 计量资料用x±s表示，组间差异比较采用单因素方差分析，使用SPSS11.0统计软件进行统计描述。
2 结 果
2.1 各组大鼠基本资料比较 实验第2、4、8周后，DM组血糖、尿素、24 h尿白蛋白、血肌酐均高于对照组差异显著(P<0.05)，而体重低于对照组(P<0.01);氯沙坦组尿白蛋白排泄虽能缓解，但尚不能恢复正常水平(P<0.01)。氯沙坦治疗后对其他指标无明显影响，DM组和氯沙坦组血糖水平无明显差异(P >0.05)，见表1。
2.2 RTPCR检测肾皮质ColⅣ、FN和TGFβ1 mRNA的表达 在各组观察时间点DM组和氯沙坦组TGFβ1、FN和ColⅣ mRNA均高于对照组(P<0.01或P<0.05);在4、8 w时，氯沙坦组TGFβ1、FN、ColⅣ mRNA均低于DM组(P<0.05)，见表2。表1 各组大鼠一般参数比较表2 各组肾组织ColⅣ、TGFβ1 mRNA的表达比较与对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01;与DM组比较：3)P<0.05
3 讨 论
有实验〔1〕研究表明，TGFβ1可刺激培养的近端肾小球肾小管上皮细胞合成外基质，并可抑制细胞外基质降解酶的合成，使细胞外基质分解受到抑制，这两方面促进了细胞外基质积聚。Kawano等〔2〕学者将TGFβ1基因转染到大鼠肾脏后出现了细胞外基质蓄积，而在肾小球肾炎动物模型中使用抗体拮抗TGFβ1，则阻止了肾小球硬化发生。所以TGFβ1被公认为是导致细胞外基质聚集的重要细胞因子，在肾小球硬化发生机制中发挥着重要作用。本实验用STZ 70 mg/kg一次性腹腔注射建立DM大鼠模型，随病情进展大鼠体重下降，肾重、肾脏肥大指数却明显上升，证实肾脏肥大是DN的早期表现，与以往研究〔3，4〕一致。DM早期即可出现肾脏中TGFβ1、FN及ColⅣ表达升高，本实验第2周时DM大鼠中各自的表达已明显升高，这种变化能持续维持至8 w。本实验用氯沙坦干预后，结果显示氯沙坦组TGFβ1、FN及ColⅣ、mRNA降低在4、8 w时与DM组差异显著(均P<0.05)，表明氯沙坦能通过减少肾组织TGFβ1的表达，抑制FN、ColⅣ、ECM合成，从而发挥一定的肾脏保护作用。同时本资料还显示未进行干预的DM大鼠TGFβ1 mRNA的表达增强而促进ECM中FN、ColⅣ的沉积，导致DN的加重。
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