作者：陈海，孙善全，汪克建，陈通，谭戈，杨美
0引言
眼内水、电解质的运输平衡对维持眼的多项生理功能具有重要意义. 但其异常的分子机制并不十分清楚. 水通道蛋白（aquaporins, AQPs）的发现及其在眼内的广泛分布开辟了探索眼内水、电解质运输平衡的新途径［1］. 最近报道［2-3］，AQP4与Kir4.1(inwardly rectifying potassium, Kir)相耦联（coupling ），在脑内水、电解质运输平衡调节中发挥着重要作用. 这种耦联关系与AQP4和Kir4.1在某些胶质细胞特殊膜域的共表达（colocalization）有关［4］. 本实验拟通过免疫组织化学和激光扫描共聚焦显微技术，对AQP4与Kir4.1在眼内组织的定位分布及其共表达情况进行研究，为进一步探讨眼内水、电解质转运平衡及其调节机制提供形态学依据.
1材料和方法
1.1材料成年Wistar大鼠8只，雌雄各半，眼睛活动正常，外观正常，角膜透明、无损伤眼用于本研究. 多克隆兔抗Kir4.1抗体购自Sigma公司；兔抗CAQP4（碳端AQP4）购自美国Chemicon公司；二抗(通用型免疫组化检测试剂盒)为中山生物技术有限公司产品；FITC标记羊抗兔IgG, Cy3标记羊抗兔IgG等均购自武汉博士德生物试剂有限公司.
1.2方法
1．2．1眼组织准备用戊巴比妥钠（40 mg/kg）经腹腔注射麻醉大鼠后，经左心室插管，用生理盐水将血液冲洗干净，再用40 g/L多聚甲醛PBS溶液灌注固定30 min. 取眼球，于40 g/L多聚甲醛PBS溶液后固定2 h. 用0.1 mol/L PBS清洗组织，依次入50,100,150,200 g/L蔗糖（0.1 mol/L PBS配置）脱水，-20 ℃恒冷冰冻切片机矢状面连续切片，片厚为15 μm.
1.2.2免疫荧光组织化学方法切片经10 mmol/L PBS漂洗30 min，3 mL/L甲醇H2O2，10~15 min，0.1 mol/L TritonX100作用10 min；正常山羊血清封闭4 h，37℃，甩干不洗，加一抗AQP4或Kir4.1 (1∶400)，37 ℃孵育过夜，10 mmol/L PBS漂洗15 min×3次，二抗（FITC标记的羊抗兔IgG或Cy3标记的羊抗兔IgG） 90 mim，37 ℃，0.01 M PBS漂洗15 min ×3次；500 mL/L甘油-10 mmol/L PBS封片，激光共聚焦显微镜观察.
1.2.3免疫荧光双标记试验10 mmol/L PBS漂洗切片30 min，3 mL/L甲醇-H2O2，10~15 min，0.1 mol/L TritonX100作用10 min；正常山羊血清封闭4 h，37℃，用AQP4一抗(1∶400)，37℃孵育过夜，10 mmol/L PBS漂洗15 min×3次，二抗(FITC标记的羊抗兔IgG) 90 min， 37℃， 10 mmol/L PBS漂洗15 min×3次；正常山羊血清封闭4 h，37 ℃，加另一抗Kir4.1（1∶400），37℃孵育过夜，10 mmol/L PBS漂洗15 min×3次，二抗（Cy3标记的羊抗兔IgG） 90 min，37℃，10 mmol/L PBS漂洗15 min×3次，500 mL/L甘油-10 mmol/L PBS封片，激光共聚焦显微镜观察.
2结果
2.1AQP4在大鼠眼内的分布AQP4阳性着色（绿色荧光）主要集中在视网膜神经层、睫状体无色素上皮细胞）以及角膜内皮细胞、晶状体上皮细胞和虹膜后色素上皮细胞（未显示），其分布主要集中在胞膜，胞质胞核未见显色（图1，2）.
A: AQP4免疫荧光标记结果； B: Kir4.1免疫荧光标记结果； C: A/B相应部位的正常形态结构扫描图； D: AQP4与Kir4.1双重标记结果，呈黄色部位为二者的共表达（ONL: 外核层，OPL: 外网状层，INL: 内核层，IPL: 内网状层，GCL: 节细胞层； : 阳性着色的Müller细胞或星形胶质细胞胞体， →: Müller等胶质细胞突起， : 血管周围， ↓: 内界膜， →: 感光细胞外节）.
图1激光共聚焦显微镜下正常大鼠视网膜AQP4（绿色）与Kir4.1（红色）免疫荧光标记结果×400
2.2Kir4.1在大鼠眼内的分布Kir4.1在正常大鼠视网膜内呈明显的阳性表达，尤其是在小血管周围和内界膜等处的表达较强，其分布形式与AQP4的分布相似，阳性细胞胞体位于内核层和神经纤维层，其突起贯穿于整个视网膜神经层，与视网膜Müller细胞和星形胶质细胞的形态一致；此外，Kir4.1在睫状体靠近房水面无色素上皮细胞的基底膜面和顶膜面也有表达，其分布形式与AQP4在上述部位的分布相似（图1，2）.
A: AQP4免疫荧光标记结果；B: Kir4.1免疫荧光标记结果；C: A/B相应部位的正常形态结构扫描图；D: AQP4与Kir4.1双重标记结果，呈黄色部位为二者的共表达（→: 睫状突无色素上皮细胞， ←: 睫状突色素上皮细胞）.
图2激光共聚焦显微镜下正常大鼠睫状体AQP4（绿色）与Kir4.1（红色）免疫荧光标记结果×400
2.3免疫荧光双标为进一步探讨AQP4与Kir4.1在上述部位的分布特征，将AQP4抗体与Kir4.1抗体进行免疫荧光双标记. 结果发现，抗AQP4免疫活性和抗Kir4.1免疫活性在视网膜神经层内相叠加，尤其是在内界膜、小血管周围及感光细胞外节处，呈明显的共表达；此外，AQP4与Kir4.1在睫状体的分布也有重叠，二者共表达于无色素上皮细胞（NPE）的顶膜面及基底膜面（图1，2）.
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