作者：黄道秋 张斌 汪华蓉 丁铃
【摘要】以精原细胞法作为筛选模型，对链霉菌4209-23发酵液脂溶部分的活性成分进行研究，分离得到化合物4209-23A，通过UV、IR、MS、1 H-NMR、自从20世纪50年代初人们开始从微生物产物中筛选抗肿瘤物质以来，微生物来源的抗肿瘤药物研究发展迅速，越来越多的微生物提取物及次级代谢产物被发现具有抗肿瘤作用且作用机制多样。精原细胞法作为天然来源抗肿瘤药物的初筛方法，对检测天然来源的抗肿瘤活性物质显示了较高的敏感性与相关性 ［1］ ，通过该模型已陆续筛选到一系列抗肿瘤化合物。本文对以精原细胞法筛选得到的链霉菌4209-23发酵产物中的活性成分进行了提取分离，到一灰黑色的活性组分，通过理化性质及化学结构的研究，确定该组分为链黑菌素streptonigrin）。这是首次通过该模型筛选得到的链黑菌素。
【关键词】 链霉菌
1 实验材料
1.1 菌株与培养基
4209原株由云南微生物研究所提供（从云南土壤中分离得到），经我所筛选并分离纯化得到4209-23菌株。
斜面培养基 葡萄糖1%，酵母浸膏0.1%，牛肉汁0.1%，N-Z-Amine A（水解酪素）0.2%，pH7.3。种子及发酵培养基 蔗糖2%，饴糖1%，蛋白胨（血）0.2%，啤酒酵母粉0.5%，NaNO 3 0.1%，黄豆粉1%，pH7.0。
1.2 仪器与试剂
X5型大孔吸附树脂（天津南开大学化工厂），100 ～200目柱色谱用硅胶H60（青岛海洋化工厂），中压ODS/C18 柱（ULTRA PACK ODS30/50（15mm×300mm，5μm），旋转蒸发仪（BüCHI-011，Switzer-land），X4 型显微熔点测定仪（上海分析仪器厂），高效液相色谱仪（Shimadzu LC-10Avp，柱型号为Inertsil ODS-2（4.6mm×150mm，5μm），紫外光谱仪（Shi-madzu UV-2201），红外光谱仪（Nicolet Impact400FR-IR），质谱仪（AccuTof CSLCMS），核磁共振仪（Bruker AM-500）。
2.1 活性跟踪方法
以精原细胞法结合平行菌法（金葡菌209P）对分离过程进行活性跟踪，表1为在筛选分离活性物质过程中各重要步骤测活数据，其中的各个组分均有杀精原细胞活性。
2.2 发酵
以在B斜面培养基上28℃培养10d的链霉菌 表1发酵液（pH8.0） 21发酵液（pH7.0） 21X5柱50%丙酮洗脱部分 25乙酸乙酯萃取部分 29硅胶柱甲醇洗脱部分 284209-23A纯品 30 4209-23作为菌种，接种于种子培养基中（1支斜面种2瓶种子，80ml/500ml），28℃振荡培养48h，然后转种于发酵培养基中（2瓶种子转种1瓶立瓶，700ml/5000ml），28℃来回摇床培养96h，此时生物活性最高。
2.3 提取分离与纯度鉴定
将11L发酵液过滤，滤液调pH至7.0后通过X5型大孔吸附树脂，弃去流出液，用50%丙酮洗脱，收集洗脱液并挥去丙酮，用乙酸乙酯萃取，并通过旋转蒸发仪浓缩萃取液得到粗品。用少量乙酸乙酯溶解粗品，上样于硅胶H柱，梯度洗脱，洗脱液分别为乙酸乙酯200ml，乙酸乙酯:甲醇（1∶1）200ml，甲醇400ml。收集并浓缩甲醇洗脱部分，以45%甲醇∶水溶解，上样于ODS/C18 反相中压柱，以45%甲醇∶水系统洗脱，得一灰黑色成分，冻干后为4mg。经HPLC检测，流动相为50%甲醇∶水（含0.05%TFA），检测波长215nm，柱温30℃，得到单一对称峰，保留时间为11.605min。
2.4 理化性质及结构鉴别
4209-23A为灰黑色无定形粉末，熔点:272～274℃，易溶于二氧六环、吡啶、二甲基甲酰胺，可溶于甲醇、丙酮，微溶于苯、二氯甲烷、乙醚。UVλMeOH （nm）:203，245，386。红外光谱:υKBr （cm -1 ）:3450及3348的两个尖锐强峰为υN-H 振动，1684cm -1 为共轭的羧酸的羰基振动，1610cm-1 为苯环的骨架振动。
ESI-MS（positive）:m/z507［M+H］，528［M+Na］，分子量为506，又由HRMS:m/z507.15214［M+H］确定分子式为C 25 H22 N 4 O 8 。
根据氢谱及DEPT谱可知，该化合物有1个 CH 3 ，3个OCH 3 ，4个CH，其中低场的2个CH互相偶合，偶合常数8Hz，说明在芳香环上。另外2个低场的H在氢谱上重叠于一起，形成一个尖锐的单峰，与文献［2］比较可知，该化合物用DMSO-d6 溶解做谱时，这两个氢化学位移近乎一致;而用CDCl 溶解做谱时则可分开且有一定的偶合常数。根据D2 O交换氢谱可知最低场的一个H及化学位移为6.850的H为活泼氢，另外羧基上的活泼H在该谱上没有显示（表2）。然后根据HMQC确定与H直接所连的C的化学位移，结合HMBC推断结构，与文献［2，3］相对照，可知该化合物即为链黑菌素，其结构如图1。
3 讨论
链霉菌4209-23是经过精原细胞法检测约2000个放线菌发酵液筛选得到的活性菌株之一，经过分类鉴定为一链霉菌新种，其发酵过程受外界温度影响较大，发酵不稳定，易染菌，代谢产物复杂且各成分含量较小。化合物链黑菌素为首次通过该模型筛选得到，具有强烈的杀精原细胞活性，其具体的化学结构研究国内未见报道，该化合物抗肿瘤活性显著，但是毒副作用1 H-NMR谱中未见。 较大，国外对其具体的抗肿瘤机制进行了一系列的研究［2］ ，因此如何改造其结构，降低毒副作用，需要进一步更深入的研究。
【参考文献】
［1］甄永苏，薛玉川，邵荣光.烯二炔类新抗生素C1027的抗肿瘤作用研究［J］.中国抗生素杂志，1994，19（2）:164
［2］Wang H，Yeo S L，Xu J，et al.Isolation of streptonigrin and its novel derivative from Micromonospora as inducing agents of p53-dependent cell apoptosis ［J］.J Nat Prod，2002，65（5）:721
［3］Pia I A，Ian J L，Margaret M H.Assignment of the13 C and15 N NMR spectra of the antitumour antibiotic strep-tonigrin ［J］.Magn Reson Chem，2002，40（4）:313 |
