王泓   钱锦   孙晓东

上海交通大学附属第一人民医院   200080

目的：探讨内质网应激凋亡途径的转录因子GADD153是否参与调控视网膜脱离后的细胞凋亡过程。

方法：设计针对GADD153的有效RNA干扰片段，阳性克隆经过DNA测序鉴定后，进行慢病毒小量包装。慢病毒滴度测定后，用RT-PCR和Western方法在体外培养的293T细胞中进行有效靶点的筛选。124只大鼠随机分为正常对照组4只，视网膜脱离组40只，阴性病毒载体对照组40只和GADD153-shRNA慢病毒载体组40只。用半定量RT-PCR 检测GADD153、Bcl-2和Bax mRNA 的表达；用Western blot 检测GADD153、Bcl-2和Bax蛋白水平的表达；运用TUNEL 联合共聚焦显微镜检测视网膜的细胞凋亡情况；运用免疫荧光联合激光共聚焦显微镜检测GADD153 在视网膜的表达与分布。记录ONL的厚度。

结果：DNA测序鉴定显示重组质粒中含有所设计的寡核昔酸单链，序列正确。转染Lv-GADD-Sh-2的293T细胞中GADD153蛋白质及基因表达水平显著下降，Lv-GADD-Sh-2抑制GADD153表达的作用最强。视网膜下注射组7d即能看到GFP表达，14d时表达到高峰且转染到视网膜外层，28d时仍有表达，玻璃体腔内注射组28才有很微弱表达。与视网膜脱离组和阴性病毒载体对照组相比，GADD153-shRNA慢病毒载体组的GADD153 和Bax的mRNA和蛋白表达降低(P<0.05)，Bcl-2的mRNA和蛋白表达增加(P<0.05)，视网膜脱离后凋亡细胞数减少(P<0.05)，视网膜ONL厚度增加(P<0.05)。

结论：GADD153参与了RD后光感受器细胞的凋亡过程，其机制可能是通过下调Bcl-2和上调Bax。