【摘要】 目的：探讨血管生成抑制因子内皮抑素（endostatin, ES）对培养的血管内皮细胞增殖的影响，以获得最佳作用浓度、作用时间及最佳条件。 方法：将培养ECV304细胞分别培养在含倍比稀释的ES培养液中，其中培养液分为有无血清和VEGF无血清组，在不同的作用时间（24,48h及72h），应用甲基噻唑基四唑（MTT）比色法测定ES对ECV304细胞增殖的影响。 结果：ES可显著抑制各种条件下ECV304细胞的增殖，以无血清条件下抑制作用达到最大，ES作用于ECV304细胞的最佳作用敏感时间区为24～48h，最佳作用浓度敏感区为157～2500mg/L。结论：ES对各种条件下ECV304细胞增殖有明显抑制作用，但未发现诱导内皮细胞凋亡。
【关键词】 血管生成抑制剂 内皮抑素 细胞培养 血管内皮生长因子
0引言
内皮抑素（endostatin, ES）是OReilly等在1997年从鼠血管内皮细胞瘤（EOMA）中分离和提纯出来的一种多肽[1]，分子量为20kDa，经氨基酸序列分析提示，ES为胶原纤维ⅩⅧ型C－末端非胶原区（NC）的184个氨基酸片断（132～315），许多研究表明ES通过特异性抑制血管内皮细胞的增殖达到抑制新生血管生成的目的。本研究主要应用不同浓度的ES作用于不同条件下的ECV304内皮细胞，MTT法测定ES对血管内皮细胞增殖抑制作用，以获得最佳作用浓度、最佳作用时间及最佳作用条件，为下一步应用于体内实验研究作基础。
1材料和方法
1.1材料 细胞：人脐静脉内皮细胞株ECV304由中科院上海细胞库提供。主要生化试剂：ES 购自美国Calbiochem公司，内皮细胞生长因子(endothelial cell growth factor, ECGF)购自德国Roche公司，血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）购自美国Sigma公司，甲基噻唑基四唑（MTT）购自美国Sigma公司，兔抗人Ⅷ因子抗体由深圳晶美公司提供。
1.2方法
1.2.1血管内皮细胞ECV304的复苏、培养、传代及鉴定将ECV304细胞的冻存液在37℃水浴锅内快速融化，1000r/min离心15min，弃上清，沉淀细胞用培养液重悬并轻轻吹打混匀，形成细胞悬液，而后接种于培养瓶中，置入恒温CO2培养箱（50mL/L CO2，37℃）孵育。第2d换液，以后每2～3d换液一次。待细胞长至融合状态时，细胞用PBS清洗两遍，然后加入1.25g/L胰蛋白酶1～2mL，在倒置显微镜下观察，待细胞间隙增大，细胞回缩变圆时，立即将胰蛋白酶倒掉，加入培养液终止消化，用弯头吸管反复吹打瓶壁细胞，使大部分细胞脱落形成细胞悬液；倒置显微镜下计数，以1.0×105/mL密度接种于新的培养瓶，恒温培养箱培养。细胞鉴定：培养细胞经950mL/L甲醇固定30min后，0.01mmol/L PBS冲洗3min，室温下3mL/L甲醇/H2O2处理5min，1g/L胰蛋白酶消化5min，PBS洗3min，加入兔抗人Ⅷ因子抗体（1∶200），4℃过夜，PBS洗3min，加入生物素标记的羊抗兔IgG（1∶200），37℃孵育50min，PBS洗3min，DAB呈色，苏木素复染，中性树胶封片，光镜下观察，拍照。
1.2.2实验分组 （1）有血清组：取同代对数生长期细胞，用PBS清洗，加入1.25g/L胰蛋白酶消化，倒掉后，用PBS反复冲洗吹打瓶壁，形成细胞悬液，倒置显微镜下计数，稀释成2.5×103密度接种于96孔培养板中，每孔100μL，培养8h后弃培养液，各孔加入含100mL/L血清的无糖RPMI 1640培养液，实验组分别加入含有不同浓度ES（mg/L） 10000,5000,2500,1250,625,313,157的有血清培养液补足200μL，对照组不加ES，加入同等体积的有血清培养液，空白组不加ECV304细胞及ES，加入同等体积的PBS代替。培养24,48,72h后，每孔加入灭菌的PBS液配制的5mg/mL MTT溶液20μL，在细胞培养箱内孵育4h后，终止培养，小心吸出上清液，每孔加DMSO 150μL，振荡10min，使紫色结晶彻底溶解。在酶标仪上测定490nm处的吸光度（A）值，记录数据进行处理。A值与活细胞成正相关。实验结果以A值及细胞增殖抑制率I＝（A对照A实验）/A对照表示，重复三次在恒温CO2培养箱孵育24h。（2）无血清组：实验组和对照组的培养液中均不含血清，其余同（1）。（3）含VEGF的无血清组：实验组和对照组分别加入含VEGF 100mg/L的无血清培养液，其余实验步骤同（1）。
统计学处理：测量到的A值采用方差分析和组间t检验，数据处理由统计学分析软件SPSS 10.0完成，P<0.05代表差异有统计学意义。
2结果
2.1血管内皮细胞的复苏、培养、传代及鉴定 成功复苏的ECV304细胞在培养瓶中贴壁生长，呈扁平的短梭形，多角形单层镶嵌排列（图1）。Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学染色：内皮细胞核周、胞浆呈黄色的阳性反应，证实为血管内皮细胞（图2）。
2.2细胞形态学变化 在相差倒置显微镜下观察ES作用24，48，72h后ECV304活细胞的形态无明显变化，未见细胞变圆及细胞脱壁悬浮。仅见视野中细胞数目较对照组减少，增殖减慢。
2.3 ES对血管内皮细胞增殖的影响
2.3.1不同浓度的对培养的ECV304细胞的抑制增殖作用 从表13中可以看出，有血清组、无血清组及VEGF+无血清组分别加入ES（157，313，625，1250，2500，5000，10000mg/L）作用后对ECV304细胞均有明显抑制增殖作用，并呈浓度依赖性，ES浓度在157～2500mg/L时，I值变化最明显，说明此段浓度为敏感区，浓度达到2500mg/L抑制效果达到最佳，高于此浓度后抑制作用基本进入平台期，增加ES浓度，增殖抑制率未见明显增加。通过统计学分析，有血清组、无血清组和VEGF+无血清组ES抑制增殖作用均较对照组有显著差异，P<0.05。
2.3.2 ES作用不同时间对培养的ECV304细胞的抑制增殖作用 从表13中可以看出， 0～48h之间I值变化最明显，此段为作用时间敏感区，48h时三组ES作用达到最强，其中以无血清条件下抑制增殖率达到最大值为55.43％，随着时间的延长，三组并未见抑制增殖率的显著增强。
图1正常培养的ECV304细胞（×100）
图2Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学染色（×100）
2.3.3 VEGF对ECV304细胞的促增殖作用 VEGF+无血清组与无血清组中对照组相比较，100mg/L的VEGF可显著促进ECV304细胞的增殖，二者经统计学比较差异具有显著性，P<0.05。
3讨论
抗血管生成治疗的目的在于减少新生血管的发生或降低其生长速度，使其对机体的危害大大降低，治疗目的主要是达到细胞抑制而不是细胞毒效应。抗血管生成药物众多，目前最为瞩目的是ES，是已鉴定出的血管生成直接抑制药物，并可重复给药并且无耐药性。本实验应用体外培养的人脐静脉血管内皮细胞作为实验对象，加入ES作用后，MTT法测定增殖抑制率，结果表明ES可显著抑制各种条件下ECV304细胞的增殖，以无血清条件下抑制作用达到最大，ES作用于ECV304细胞的最佳作用敏感时间区为24～48h，最佳作用浓度敏感区为157～2500mg/L。VEGF被认为是在生理和病理的血管生成中必不可少的重要诱导因子，可刺激血管内皮细胞的有丝分裂、迁徙，增加血管的通透性、诱导毛细血管的形成，抑制VEGF的作用成为治疗新生血管的潜在途径。本实验应用VEGF诱导血管内皮细胞增殖，用不同浓度的ES作用于内皮细胞，结果表明ES可以在不同时段都可抑制VEGF诱导的内皮细胞增殖，与对照组相比有统计学差异（P<0.05）。
ES抑制血管内皮细胞增殖的作用机制目前尚未明了，最新研究进展认为内皮细胞将内皮抑素内吞后，使接头蛋白Shb磷酸化，形成一种125kDa的具有酪氨酸激酶活性的复合物，引起内皮细胞G1期阻滞、凋亡，抑制新生血管的形成[2]。也有研究认为内皮抑素可以与金属蛋白酶前体蛋白（ProMatrix Metalloproteinase）形成稳定的复合体，阻止基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）的激活[3]，MMP为中性内肽酶，可单独或者与其他酶一起降解细胞外基质成分，使血管内皮细胞增殖、迁移，抑制其 表1有血清组ES对ECV304细胞的作用A值及I值表2无血清组ES对ECV304细胞的抑制作用A值及I值表3VEGF+无血清组ES对ECV304细胞的抑制作用A值及I值各组组内均有P<0.05 vs对照组
激活可以抑制血管生成；另有研究表明内皮抑素可诱导内皮细胞产生凋亡，从而抑制内皮细胞的生长，但是也有研究表明未见有细胞凋亡的出现[4]。本实验应用不同浓度的ES对血管内皮细胞进行增殖抑制，从形态学上未见细胞形态发生明显改变，也未见凋亡小体等凋亡细胞特征性表现，因此认为ES对血管内皮细胞的作用仅限于抑制增殖，并没有诱导内皮细胞凋亡。
【参考文献】
1 OReilly MS, Boehm T, Shing Y, et al. Endostatin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. Cell1997;88:277285
2 DexelIus J, Larsson H, Sasaki T, et al. Endostatininduced tyrosine kinase signaling through the Shb adaptor protein regulates endothelial cell apoptosis. Blood2000;95(11):34033411
3 Kim YM, Jang JW, Lee OH, et al. Endotatin inhibits endothelial and tumor cellular invasion by blocking the activation and catalytic activity of matrix metalloproteinase. Cancer Res2000;60(19):54105413
4 Shichiri M, Hirata Y. Antiangiogenesis signals by endostatin. FASEB J2001;15:10441053
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