【摘要】 目的 观察豚鼠形觉剥夺性近视眼后极部视网膜胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R)基因表达水平的动态变化，以及IGF-1R反义寡核苷酸玻璃体腔注射对形觉剥夺性近视眼屈光度及眼轴长度的影响，探讨视网膜IGF-1R在实验性近视眼发病中的作用。方法 3周龄的三色豚鼠64只，随机均分为8组(每组8只)，A组：单眼遮盖7 d;B组：未遮盖7 d;C组：单眼遮盖14 d;D组：未遮盖14 d;E组：单眼遮盖14 d后去遮盖7 d;F组：未遮盖21 d;G组：单眼遮盖14 d+玻璃体腔注射40 ?滋g(20 ?滋l) IGF-1R正义寡核苷酸;H组：单眼遮盖14 d+玻璃体腔注射40 ?滋g(20 ?滋l) IGF-1R反义寡核苷酸。检测各组的近视屈光度、眼轴长度以及后极部视网膜IGF-1R mRNA和蛋白质的表达水平。结果 遮盖14 d后实验眼眼轴明显延长，形成近视，去遮盖7 d后，近视屈光度减低，眼轴增长减缓;随着遮盖时间的延长，后极部视网膜IGF-1R表达水平明显上调，去遮盖后，表达水平降低(P=0.000)。形觉剥夺14 d后，IGF-1R正义寡核苷酸注射眼的眼轴长度、近视屈光度以及后极部视网膜IGF-1R表达水平与单纯遮盖组无显著差异(P=0.664，0.797，0.312，0.117);但IGF-1R反义寡核苷酸注射眼的近视屈光度显著减低，眼轴变短，后极部视网膜IGF-1R mRNA和蛋白质表达水平均明显下调(P=0.000)。结论 形觉剥夺能上调豚鼠眼后极部视网膜IGF-1R的表达水平，去遮盖后，豚鼠近视屈光度减低，眼轴增长减缓，后极部视网膜IGF-1R 的表达水平下调。利用反义寡核苷酸技术抑制视网膜IGF-1R基因的表达，可以抑制近视的发展。

　　【关键词】 近视;胰岛素样生长因子1受体;反义寡核苷酸;形觉剥夺性近视

　　Inhibition of IGF-1R antisense oligonucleotides on FDM in the guinea pig

　　DENG Zhihong*， TAN Jia， LIU Shuangzhen， et al.

　　* Eye Center， Tianjin Medical University， Tianjin China，300070

　　[Abstract] Objective To investigate the dynamic expression of insulin-like growth factor 1 receptor in the posterior retina， refractive error and eye axial length after intravitreous injection of IGF-1R antisense oligonucleotides (ASON); to study the role of IGF-1R in the development of form-deprivation myopia (FDM) in the guinea pig. Methods Sixty-four 3-week-old guinea pigs were included in the study. The guinea pigs were randomly divided into 8 groups： group A underwent form deprivation (FD) for 7 days(d)， group B was the non-FD group for 7 d， group C underwent FD for 14 d， group D was the non-FD group for 14 d， group E had 7 d of recovery after 14 d of FD， group F was the non-FD group for 21 d， group G received an intravitreous injection of 40 ?滋g IGF-1R antisense oligonucleotides to FD eyes， group H received an intravitreous injection of 40 ?滋g IGF-1R ASON to MD eyes. The refractive error and axial length of the experimental eye were measured， the expression of IGF-1R mRNA and protein were assayed by RT-PCR and Western blot. Results After 14 d， the axial length of FD eyes increased， and the eyes were highly myopic. After 7 d of recovery， the degree of myopia and axial length decreased. The level of IGF-1R expression in the posterior retina of FD eyes was upgraded with a longer FD time， then decreased after recovery (P=0.000). There was no significant difference in the degree of myopia， axial length or the level of IGF-1R expression between groups G and C (P=0.664， 0.797， 0.312， 0.117). However， the degree of myopia， axial length and level of IGF-1R expression in the group that received an intravitreous injection of IGF-1R ASON (group H) were significantly less than group C (P=0.000). Conclusion FD can up-regulate the level of retinal IGF-1R expression in the guinea pig. The degree of myopia， axial length and the level of retinal IGF-1R expression decreased after 7 d of recovery. By inhibiting the expression of the retinal IGF-1R gene with ASON， the development of FDM was blocked.

　　[Key words] myopia; insulin-like growth factor 1 receptor; antisense oligonucleotide; form-deprivation myopia

　　实验性近视的研究表明胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor 2，IGF-2)在眼球的早期发育过程中起重要作用[1-2]，它通过与胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R)结合，作为近视信号参与调控近视形成。我们检测了豚鼠形觉剥夺性近视眼(form-deprivation myopia，FDM)后极部视网膜IGF-1R表达水平的动态变化，并用IGF-1R反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides，ASON)抑制后极部视网膜IGF-1R的表达，观察其对FDM眼屈光度及眼轴长度的影响，现报告如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 3周龄的三色豚鼠64只，随机均分为8组(每组8只)，A组：单眼遮盖7 d;B组：未遮盖7 d;C组：单眼遮盖14 d;D组：未遮盖14 d;E组：单眼遮盖14 d后去遮盖7 d;F组：未遮盖21 d;G组：单眼遮盖14 d+玻璃体腔注射40 ?滋g(20 ?滋l) IGF-1R正义寡核苷酸(sense oligonucleotides，SON);H组：单眼遮盖14 d+玻璃体腔注射40 ?滋g(20 ?滋l) IGF-1R ASON注射。

　　1.2 实验处理

　　1.2.1 近视模型的制作及处理 取3周龄豚鼠，遮盖组右眼以半透明薄壁塑料眼罩遮盖造成形觉剥夺。分笼饲养，室内日光灯照明，每天光照与黑暗周期为12 h/12 h。G、H组豚鼠于形觉剥夺后第1天、第8天用微量注射器向其玻璃体内注射预定药物，注射体积均为20 ?滋l。

　　1.2.2 屈光度及眼轴测量 A、B组于实验第7天，C、D、G、H组于实验第14天，E、F组于实验第21天，在自然状态下，由同一验光师用视网膜检影镜测量双眼屈光度，以氯胺酮+氯丙嗪麻醉后用A型超声测量眼轴，测量3次后取平均值作为最终结果。

　　1.2.3 标本采集 A、B组于实验第7天，C、D、G、H组于实验第14天，E、F组于实验第21天，处死试验豚鼠，快速摘取眼球，立即以7 mm直径环钻钻取后极部眼球壁，在试验显微镜下分离视网膜后液氮保存。

　　1.2.4 后极部视网膜总RNA制备 以Trizol(购自晶美生物工程有限公司)按常规提取RNA，用DU-70紫外分光光度计测量RNA质量和浓度，OD260/280比值为1.8~2.0。同时，1%甲醛变性凝胶电泳三条带显示清晰，确定RNA无明显降解。

　　1.2.5 IGF-1R反义寡核苷酸(ASON)和正义寡核苷酸(SON)由上海鼎安生物科技有限公司合成。ASON和SON的序列分别为：5′gcgccagacttcattcct c 3′，5′gaggaatgaagtctggcg c 3′(全硫代修饰)，溶于双蒸水备用。

　　1.2.6 RT-PCR 逆转录试剂盒、PCR试剂盒、DNA分子量Marker购自晶美生物工程有限公司， 引物由上海华大基因生物公司合成，引物序列： IGF-1R：Sense 5′acaccaggaacaacggagag 3′，ˊAnti-sense 5′aggcaggtctacatccacca3′ˊ，产物为415 bp;参照物?茁-actin： Sense 5′gtgggaatgggtcagaagg3′，Anti-sense 5′ ccaagaaggaaggctggaa 3′，产物为215 bp。反应条件：逆转录，42℃温育30 min，94℃变性2 min。PCR反应条件为：94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s。两体系均取35个循环进行反应，最后72℃ 10 min，4℃保存。反应产物5 ?滋l加2.5 ?滋l载样缓冲液，在2×TBE电泳缓冲液中以1.5%琼脂糖凝胶电泳，电泳完毕后照相，并用图像分析仪进行图像分析处理。

　　1.2.7 Western-blot 　视网膜蛋白样品的制备及蛋白定量：取豚鼠视网膜组织，加入全细胞裂解液200 μL，冰上匀浆器匀浆，4℃高速离心10 min，取上清液备用，分光光度计测定蛋白浓度。

　　十二酰基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳2和Western Blotting：按常规方法制备120 g/L分离胶和40 g/L浓缩胶。每份样本加入变性液，煮沸5 min，上样每孔内确保加样品的蛋白总量相等，同时加入Marker。电泳完毕后转移至硝酸纤维素膜，用含50 g/L脱脂奶粉的 TBST液封闭 硝酸纤维素膜1 h;然后加入1∶1 000兔抗鼠IGF-1R抗体(购自SANTA CRUZ，美国)，室温振荡1 h，加入1∶2 000辣根酶标记IgG和Marker抗体，室温振荡1 h，清洗后，将PVDF膜放入强化学发光试剂中1 min，轻轻摇动，保鲜膜包裹后，经X光片曝光，显影定影，显示特异的蛋白信号。用全自动图像分析系统对免疫印迹信号进行分析。

　　1.3 统计学分析 采用SPSS 11.5对试验数据进行正态分析及方差齐性检验，在此基础上行t检验、F检验等统计学处理。

　　2 结果

　　2.1 形觉剥夺后豚鼠的屈光度和眼轴的改变 遮盖7 d后实验组(A组)眼轴较对照组(B组)明显增长，形成近视(t=-48.626，-72.118;P=0.000);随遮盖时间的延长，遮盖眼近视屈光度增加，眼轴增长更明显(F=788.38，434.61;P=0.000)，遮盖14 d时实验组(C组)形成高度近视[ (-6.003±1.132)D]。去遮盖7 d后，(E组)近视屈光度减少(t=-33.118;P=0.001)，眼轴较去遮盖前(C组)无明显增长，甚至有缩短的趋势(t=6.383;P=0.354)，但与对照组(F组)相比，其近视屈光度仍明显增加，眼轴增长(t=-66.330，-43.266;P=0.000)(见表1)。

　　随时间的延长，对照组远视屈光度逐渐降低，眼轴增长(F=59.21，312.67;P=0.009，0.01)，有向正视化发展的趋势(见表1)。

　　2.2 豚鼠FDM眼后极部视网膜IGF-1R表达水平的变化 随遮盖时间的延长，IGF-1R mRNA和蛋白质的表达水平在实验组(A、C组)及对照组(B、D组)均逐渐升高(F=69.380，55.464;P=0.000)，但实验组明显高于对照组(t=-43.112，-38.969;P=0.000)， 去遮盖7 d后，实验组(E组)IGF-1R表达水平有所下降，但仍明显高于对照组(F组)(t=-66.434，-33.112;P=0.000)(分别见表1、图1、图2)。

　　2.3 IGF-1R反义寡核苷酸对豚鼠FDM眼轴长度和屈光度的影响 形觉剥夺14 d后，IGF-1R SON注射组(G组)的FDM眼近视屈光度、眼轴长度与单纯FDM组(C组)差异无显著性(t=-0.734，-0.692; P=0.664，0.797);但IGF-1R ASON注射组(H组)FDM眼的近视屈光度、眼轴长度均显著低于单纯FDM组(C组)(t=-11.242，-28.954;P=0.000)(见表1)。

　　2.4 IGF-1R ASON对豚鼠FDM眼后极部视网膜IGF-1R表达水平的影响 形觉剥夺14 d后， IGF-1R SON注射组(G组)FDM眼的后极部视网膜IGF-1R mRNA和蛋白质表达水平与单纯FDM组(C组)无显著差异(t=-0.565，-0.884;P=0.312，0.117);IGF-1R ASON注射组(H组)后极部视网膜IGF-1R mRNA和蛋白质的表达水平明显低于单纯FDM组(t=-26.197，-19.751;P=0.000)(分别见表1、图1、图2)。

[1] [2] 下一页