【摘要】 目的 研究胰岛素样生长因子Ⅰ型受体(insulin-1ike growth factors-ⅠR，IGF-ⅠR)反义基因对SMMC-7721肝癌细胞恶性表型的影响。方法 构建IGF-ⅠR反义基因真核表达载体，观测IGF-ⅠR反义基因对肝癌细胞恶性表型的影响。结果 IGF-ⅠR反义基因能明显下调内源性IGF-ⅠR的表达，与7721细胞、IGF-ⅠR正义细胞差异有显著性(P<0.01)。反义细胞G0/G1期明显增加(63.9%)，S期减少(19.3%)，细胞凋亡增加(5.89%)，与7721细胞、正义细胞差异有显著性(P<0.01)。反义细胞不能在软琼脂中生长，7721细胞及正义细胞则生长良好。结论 IGF-ⅠR反义基因显著下调了内源性IGF-ⅠR的表达，对SMMC-7721肝癌细胞恶性表型有明显抑制作用。
【关键词】 胰岛素样生长因子Ⅰ型受体 反义基因 凋亡 肝细胞癌
Effect of down-regulation of IGF-ⅠR on human hepatocellular carcinoma cells
ZHANG Qi-jie, ZHOU Ping.Department of Gastroenterology, Central Hospital of Zibo City, Shandong 255036，China
【Abstract】 Objective To study the effect of antisense gene to I type of insulin like growth factor (IGF-ⅠR) on malignant phenotype of SMMC-7721 cell line of human hepatocellular carcinoma.Methods Recombinant vectors of sense and antisense gene to IGF-ⅠR were constructed and transfected into SMMC-7721 cell line by liposome method in order to study the effect of antisense gene to IGF-ⅠR on malignant phenotype of SMMC-7721 cell line of human hepatocellular carcinoma.Results The level of endogenous expression of IGF-ⅠR was down-regulated by IGF-ⅠR antisense gene transfection and its level was significant lower than 7721 and sense cells (P<0.01). In the antisense cells the proportion of G1 phase cells (63.9%) and apoptotic cells (5.89%) increased, but the proportion of S phase cells (19.3%) decreased in the antisense cells, with significant difference between antisense cells and sense and parent cells (P<0.01). The antisense cells could not grow in soft agar, but sense and parent cells could grow. Conclusion The level of endogenous expression of IGF-ⅠR in SMMC-7721 cell line of human hepatocellular carcinoma was down-regulated by IGF-ⅠR antisense gene and the malignant phenotype of SMMC-7721 cell line of human hepatocellular carcinoma is significantly inhibitted.
【Key words】 IGF-ⅠR; antisense gene; apoptosis; hepatocellular carcinoma
胰岛素样生长因子通过IGF-ⅠR介导在细胞增殖、转化及肿瘤发生、发展中发挥重要的促进作用[1,2]。本研究通过IGF-ⅠR反义基因阻断SMMC-7721肝癌细胞株IGF-ⅠR表达，观察SMMC-7721肝癌细胞株恶性表型的变化，以期为肿瘤防治提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 材料 SP免疫组化试剂盒、IGF-ⅠR多克隆抗体(北京中山公司)，质粒提取试剂盒、DNA纯化试剂盒、脂质体转染试剂盒、限制性内切酶、连接酶(Promega公司)，载体pBluescript SK(stratagene公司)、pCMVhygro(上海市肿瘤研究所)，宿主菌XL1-Blue (stratagene公司)，潮霉素(Boehringer MaDHheim公司)，MTT (华美公司)，其余均为国产优质分析纯试剂。SMMC-7721入肝癌细胞株(中科院上海细胞所)。主要实验仪器：酶联免疫检测仪，紫外分光分析仪，流式细胞仪FACSTplusBD，扫描电镜 AMRAYl000B，透射电镜 GEM 2000EX，图像分析仪 MD20型。
1.2 实验方法
1.2.1 质粒DNA的提取及纯化 按质粒提取试剂盒操作说明书操作。
1.2.2 质粒cDNA片段的回收纯化 按DNA纯化试剂盒说明书操作。
1.2.3 IGF-ⅠR正、反义真核表达重组体的构建 提取载体质粒pCMVhygro的方法同前，以Bam HI酶切，去磷酸化处理的载体质粒pCMVhygro和IGF-ⅠR cDNA插入子，按载体：插入子1：2的比例加入到连接反应体系中，氯化钙法转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞。接种扩增有插入的单菌落，提取质粒，酶切鉴定重组体。
1.2.4 细胞培养 SMMC-7721肝癌细胞在DMEM培养液中于37℃、5%CO2、饱和湿度下培养，培养基中含10%的小牛血清，青霉素100u/ml，链霉素100u/ml。
1.2.5 潮霉素毒性实验 在96孔培养板中，每孔加入200μl含200个细胞的细胞悬液，次日换成每毫升含潮霉素50、100、150、200、300、400、500μg的培养液。培养 7～10天，观察细胞克隆形成情况，确定潮霉素的筛选浓度。
1.2.6 转染实验 按脂质体转染试剂盒操作说明。
1.2.7 IGF-ⅠR cDNA蛋白表达水平的测定 应用SP免疫组化及图像分析。
1.2.8 形态学检查
1.2.8.1 光学显微镜检查 常规HE染色。
1.2.8.2 扫描电镜 细胞铺片3%戊二醛固定，0.1M PBS漂洗，酒精递度脱水，醋酸异戊酯置换，临界点干燥，镀膜，上镜观察。
1.2.8.3 透射电镜 胰酶消化细胞，细胞沉淀用3%戊二醛固定。0.1M PBS漂洗2次，饿酸后固定，丙酮递度脱水，浸透，包埋，切片，双铅染色，上镜观察。
1.2.9 流式细胞仪检测细胞周期、凋亡
1.2.10 软琼脂克隆形成实验 37℃、5%CO2、饱和湿度环境下培养14天，计数含50个细胞以上的克隆。
1.2.11 统计学分析 计量资料采用双因素、单因素方差分析，计数资料采用二维列联表分析，P<0.05认为差异有显著性。
2 结果
2.1 IGF-ⅠR正、反义真核表达重组体的构建 IGF-ⅠR目的片段与脱磷的载体pCMVhygro通过T4 DNA连接酶连接。抽提质粒后经XbaI、XhoI双酶切证实正义重组体为9.12kb、1.698kb二段，反义重组体为5.468kb、5.35kb二段。表明已成功构建了IGF-ⅠR-pCMVhygro的正、反义重组体。
2.2 潮霉素筛选浓度的确定 培养第7～10天镜下观察，潮霉素100μg/ml的筛选浓度可有效杀死未转染的细胞。
2.3 转染IGF-ⅠR正、反义真核表达重组体的细胞免疫组化及图像分析，结果显示SMMC-7721肝癌细胞IGF-ⅠR呈高表达，光密度值为252.5±71.6(n=166)，IGF-ⅠR正义细胞光密度值为240.5±83.6(n=170)，二者差异无显著性(P>0.05)，IGF-ⅠR反义细胞光密度值为127.7±46，与SMMC-7721细胞、IGF-ⅠR正义细胞比较差异有非常显著性(P<0.01，见图1～3)。提示IGF-ⅠR反义基因显著降低了IGF-ⅠR蛋白在SMMC-7721细胞中的表达。
2.4 细胞形态学改变 光学显微镜：细胞呈多角形或卵圆形，核型不规则，深染。可见核分裂象及多个核仁，反义细胞与正义细胞、SMMC-7721细胞无明显变化。扫描电镜：SMMC-7721细胞：呈多角形、椭圆形，有微绒毛，正义细胞异形性明显，呈多角形、椭圆形及梭形，微绒毛较长，反义细胞以椭圆形为主，微绒毛减少、变短。透射电镜：SMMC-7721细胞大小不等，核增大，核形不规则，核浆比例增大，游离核糖体、线粒体增多，核仁增多、增大，可见微腺腔。IGF-ⅠR正义细胞可见瘤巨细胞及明显病理性核分裂象。IGF-ⅠR反义细胞胞浆内可见微腺腔、灶性坏死、髓鞘样结构，部分细胞核浓缩、深染，细胞器破坏，并可见细胞碎片，胞浆内可见多发性低电子密度区，不规则，内似有中等电子密度丝状物质。
2.5 细胞周期及细胞凋亡 流式细胞仪检测各组细胞周期及细胞凋亡(见表1)，显示IGF-ⅠR反义细胞G1期细胞明显增加，S期细胞减少，而且凋亡增加， 与7211细胞比较差异有非常显著性(P<0.01)。IGF-ⅠR正义细胞S期细胞增加，而凋亡减少。提示IGF-ⅠR反义基因可抑制细胞增殖，促进凋亡。
2.6 软琼脂克隆形成 在双层软琼脂培养中，7天后SMMC-7721细胞与IGF-ⅠR正义基因细胞均生长良好，形成明显簇状细胞集落，而且细胞集落大，数量多，多数集落大于50个细胞。二者细胞克隆形成差异无显著性(P>0.05，见图4、5，表2)。IGF-ⅠR反义基因细胞5～7天后仅见数个克隆，而且每个克隆少于50个细胞，10天后细胞散落而死亡。说明IGF-ⅠR反义基因转染后SMMC-7721肝癌细胞锚着生长能力丧失。表1 细胞周期及凋亡注：与SMMC-7721、ⅠR -S相比*P<0.01;与SMMC-7721细胞相比**P<0.01表2 IGF-ⅠR反义基因对SMMC-7721细胞软琼脂克隆形成的影响注：与SMMC-7721细胞相比P>0.05
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