【摘要】 目的 探讨高浓度葡萄糖对内皮细胞(endothelial cell，EC)单层通透性模型通透性的影响以及血管生成素1(angiopoietin-1，Ang-1)对此的保护作用。方法 将猴脉络膜-视网膜内皮细胞(RF/6A)接种于孔径0.8 μm聚碳酸酯微孔滤膜中，形成致密单层后分三组培养。正常对照组：DMEM高糖培养基，含葡萄糖25 mmol/L;高糖组：DMEM培养基，含葡萄糖40 mmol/L;Ang-高糖组：DMEM培养基，含葡萄糖40 mmol/L+Ang-1 250 ng/ml。于第1天、第3天、第5天、第7天4个时间点建立EC单层通透性模型，检测蛋白质渗透压反射系数(δ)及滤过系数(Kf)，以监测EC单层通透性的变化;利用Western blot(NBT/BCIP显色法)检测第5天时survivin的表达。结果 第3天、第5天及第7天时，高糖组EC单层通透性增高(P<0.01)，Ang-高糖组在第5天及第7天时，EC单层通透性升高(P<0.01)，但仍低于高糖组;Western blot结果显示，Ang-高糖组survivin表达明显高于其他各组(P<0.01)。结论 高糖能够增加EC单层通透性，Ang-1能对抗高糖的这种生物学作用。它可能是通过上调凋亡抑制基因survivin的表达，抑制RF/6A的凋亡而发挥生物学作用。

　　【关键词】 脉络膜-视网膜内皮细胞;血管生成素1;葡萄糖;通透性;survivin表达

　　The effects of angiopoietin-1(Ang-1) and high-concentration glucose on rhesus macaque choroid-retinal endothelial cells (RF/6A)

　　XIAO Hong， LIU Xuezheng.

　　The First Affiliate Hospital， Liaoning Medical University， Jinzhou China， 121001

　　[Abstract] Objective To explore the effects of angiopoietin-1 (Ang-1) and high-concentration glucose on rhesus macaque choroid-retinal endothelial cells (RF/6A) with a model for detecting EC monolayer permeability. Methods RF/6A cultured on polycarbonate micropore filter membranes were divided into 3 groups (with 25 and 40 mmol/L glucose and 40 mmol/L glucose together with 250 ng/ml Ang-1). After the confluent EC monolayers were developed， they were used to detect the fluid filtration coefficient (Kf) and osmotic inflation coefficient (δ) in proteins perfused with plain Hank’s balanced salt solution， which contains 1 g/L albumin. Testing was taken on the 1st day， 3rd day， 5th day and 7th day. Western blot was also used to determine the expression of survivin on the 5th day. Results Groups responding purely to high glucose showed an increased EC monolayer permeability on the 3rd， 5th and 7th days， compared to the control group and the Ang-glucose group. This increased tendency could also be seen in the Ang-glucose group on the 5th and 7th days (P<0.01). Western blot showed a significant difference between the group with Ang-1 and the group without Ang-1. Conclusion High-concentration glucose increases EC monolayer permeability. The beneficial effect of Ang-1 limits this damage and may be a method for up regulating the expression of survivin to prevent RF/6A from apoptosis.

　　[Key words] macaque choroids-retinal endothelial(RF/6A); angiopoietin-1; glucose; permeability; expression of survivin

　　糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病患者最为常见的微血管并发症，该病治愈率低，致盲率高，是三大致盲因素之一。DR早期就有微血管渗漏的病理改变，而微血管病变是DR发病的基本环节[1]，抑制微血管渗漏对于防治DR、提高患者生活质量意义重大。血管生成素1(angiopoietin-1，Ang-1)与受体结合后可调节成熟个体新生血管生成[2-3]，可以促进视网膜微血管周细胞与血管内皮细胞(endothelial cell，EC)的接触，维持血管壁的稳定。Ang-1也可以抑制由炎症或血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)诱导的血管渗漏，能抵抗芥子油、5-羟色胺和血小板活化因子等强渗漏因子引起的血管渗漏作用，可抗血管渗漏，且无血管形态的异常[4-5]。Ang-1能加强人脐静脉内皮细胞之间的黏附连接，降低EC单层的基础通透性[6]。但是在高糖环境中，Ang-1会对EC单层通透性产生何种影响，以及如何发挥生物学效应，鲜见报道，本实验利用脉络膜-视网膜内皮细胞RF/6A这一EC对此进行了初探。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 猴脉络膜-视网膜内皮细胞(购自中科院上海细胞库)，胎牛血清(华美生物工程公司)，考马斯亮蓝(南京建成生物公司)，DMEM培养基(Gibco生物工程公司)，D-葡萄糖(Sigma公司)，Ang-1(Sigma公司)，直径25 mm、孔径0.8 μm的聚碳酸酯微孔滤膜(whatman公司)，电泳仪(PowerPac 3000，BIO-RAD公司)，超声波细胞粉碎机(92-Ⅱ型，宁波新芝科器研究所)。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 聚碳酸酯微孔滤膜的处理 参照文献[7]、[8]的方法，将聚碳酸酯微孔滤膜(直径25 mm、孔径0.8 μm)依次浸入80℃、0.5% 醋酸20 min，25℃蒸馏水中漂洗2遍，0.5 g/L明胶溶液内80℃孵育60 min后，置于6孔培养板内，放入80℃烘箱内3 h，再于超净工作台内，以紫外灯连续照射24 h，备用。

　　1.2.2 细胞培养及实验分组 将猴脉络膜-视网膜内皮细胞(RF/6A)置DMEM高糖完全培养基中，于37℃、5%CO2、饱和湿度孵箱中培养，按照1∶2～1∶4传代培养。以1.5×106/cm2的密度接种于培养板内预处理的微孔滤膜，待形成致密EC单层后换为实验培养基，以DMEM高糖培养基为基础培养基，添加D-葡萄糖和Ang-1配置成条件培养基。共分三组，正常对照组：普通高糖培养基，含葡萄糖25 mmol/L;高糖组：含葡萄糖40 mmol/L;Ang-高糖组：含葡萄糖40 mmol/L+Ang-1 250 ng/ml。

　　1.2.3 致密EC单层形成的判定 镜下见培养板底部未被滤膜覆盖部分长满细胞，可初步判定滤膜上的细胞已形成致密单层。预实验中为进一步验证，取出接种EC的滤膜，用D-Hanks液漂洗2次，再用2% 甲醛和1% 戊二醛混合液固定10～20 min，然后以0.125%考马氏亮蓝R250(溶于5∶4∶1的甲醇：水：冰醋酸混合液)于室温下染色40～60 min，蒸馏水漂洗后，置于载玻片上，以光镜观察滤膜表面EC生长融合情况。

　　1.2.4 EC单层通透性模型的建立 初步判断EC已经形成致密单层后，换为实验培养基进行分组培养。分别于第1天、第3天、第5天、第7天将滤膜取出，用D-Hanks漂洗2遍，装入针头式滤器(有效滤过面积为3.14 cm2)[8]，针式滤器上腔以1 g/L牛血清白蛋白溶液(溶于D-Hanks液)于注射器内灌注，液体高度为25 cm，压力为2.45 kPa。先平衡5 min，收集第5～第10分钟时的液体，记录流出液体积，以考马斯亮蓝法检测下腔收集液蛋白浓度。

　　1.2.5 滤过系数Kf及渗透压反射系数δ的测定 在该EC单层通透性模型装置中，主要是由于超滤作用使得蛋白质能够通过EC单层，弥散作用极小，故EC单层对蛋白质的渗透压反射系数可按如下公式计算：δ=1-CF/CP，其中CF与CP分别是下腔和上腔液体中白蛋白的浓度。另据Staring的血管内外液体交换的数学模型可以计算EC单层的滤过系数：Kf=Jv /(△P-δ·△π)，其中，Jv是流出液生成速度(?滋l·min-1·cm2)，△P是灌注压力，单位是kPa。δ是渗透压反射系数，△π是灌注液和流出液的胶体渗透压差。在测得蛋白浓度的情况下，胶体渗透压按von Hoff定律计算：π(kPa)=2.6·C，其中C为蛋白毫渗量浓度，单位是(mOsm·L-1)，2.6是换算系数，单位是(kPa·L·mOsm-1)。

　　1.2.6 Western blot检测survivin表达 细胞于37℃、5% CO2、饱和湿度孵箱中分组培养5 d。去培养液后用温PBS冲洗2～3遍，加入适量的预冷裂解液置于冰上裂解15 min。用细胞刮刮下细胞，收集于EP管内，超声(200 w)3 s×2次以裂解细胞，再在4℃、12000 g时离心2 min。采用考马斯亮蓝法，测定上清液蛋白浓度，将所有蛋白样品调至等浓度上样(上样前于100℃水浴3 min)，以80 V电压常规SDS-PAGE电泳后转移到硝酸纤维膜上，用封闭液(1×TBST，5%脱脂奶粉)于 4℃封闭过夜，再用抗体稀释液(1×TBST，1%脱脂奶粉) 1∶250稀释一抗，与经封闭液处理的PVDF膜置于小封口塑料袋内于37℃孵育2 h。用1×TBST液洗膜3次，每次20 min。然后，以同样方法，1∶4500稀释二抗，37℃孵育1 h，1×TBST液洗膜30 min×3次。将膜置于含BCIP(33 μl)/NBT(66 μl)的10 ml染色液中，于室温下轻轻摇晃，使蛋白条带逐渐显影、定影，胶片洗涤、干燥，利用Kodak电泳图像分析系统对图片各电泳条带亮度进行扫描，对各组电泳条带的显影相对强度进行统计分析。

　　1.3 统计学方法 用SPSS 13.0统计软件，采用方差分析与LSD-t检验对实验结果进行分析判定。

　　2 结果

　　2.1 EC单层的光镜观察 在滤膜上以1.5×106/cm2的密度接种RF/6A，一般经过3～4 d后可以形成致密的RF/6A单层。镜下见培养板底部无滤膜覆盖部分EC生长致密达100%融合后(见图1)，取出滤膜，固定、考马斯亮蓝R250染色后，镜下见滤膜上细胞生长融合亦达100%(见图2)。可见，以培养板底部滤膜未覆盖区细胞生长融合情况，来判定滤膜上EC生长融合情况是可靠的。

　　2.2 蛋白质渗透压反射系数δ的变化 δ是反映EC单层通透性的指标，δ值越大，EC单层通透性越低。第1天时，各组之间差异无统计学意义(P>0.05)，第3天、第5天及第7天时，高糖组δ值低于正常对照组(P<0.01)和Ang-高糖组(P<0.05)。Ang-高糖组在第5天及第7天时较正常对照组也有所降低(P<0.05，见表1)。

　　2.3 滤过系数Kf的变化 Kf也是反映EC单层通透性的指标，Kf越大，EC单层通透性越大。第1天时，组间无差别(P>0.05)，第3天、第5天及第7天时，高糖组Kf值高于正常对照组(P<0.01)和Ang-高糖组(P<0.05)。Ang-高糖组在第5天及第7天时Kf值较正常对照组均有所增高(P<0.05，见表2)。

　　2.4 survivin表达的Western blot检测结果 对survivin表达进行Western blot(NBT/BCIP化学显色法)分析结果显示Ang-高糖组凋亡抑制基因survivin表达量明显高于其他各组(见图3、表3)。

　　3 讨论

　　视网膜微血管的渗漏是DR的重要环节。本实验以聚碳酸酯微孔滤膜为载体，形成的EC单层更接近生理状态[9]，能较好地模拟体内高糖对视网膜微血管渗漏的影响。通过Kf和δ这两个反映EC单层通透性最敏感的指标[9]，可以对EC单层通透性模型进行检测，灵敏地反映EC单层通透性的变化，同时也可以更准确地推测各处理因素对在体实验的作用效果。

　　Kf和δ的检测结果显示，与正常对照组相比，高糖组δ有所降低，Kf有所增加，显示EC单层通透性增加。高糖可以直接刺激糖酵解途径造成细胞损伤[10]，可导致EC内还原型烟酰胺腺嘌呤NADH堆积，产生功能性缺氧，造成EC因代谢供氧不足受到损伤[11]。高浓度葡萄糖造成的EC单层通透性增强，很可能是由于EC凋亡增加导致滤膜表面存活的细胞减少，细胞间隙增大，原本致密的EC单层受损所致。

　　实验中Ang-高糖组survivin表达明显高于其他两组。survivin是迄今发现的最强的凋亡抑制因子，其抑制细胞凋亡的作用远大于Bcl-2家族成员[12]。Ang-1可以通过激活跨膜的信号传导路径PI3K/Akt，抑制线粒体酶释放，上调凋亡抑制基因survivin的表达，拮抗内皮细胞调亡[13-14]。本实验中Ang-高糖组survivin表达明显高于其他各组，这表明Ang-1也能上调高糖环境中EC survivin的表达。Ang-1能降低高糖环境中EC单层通透性，原因很可能是由于凋亡抑制基因survivin表达上调，细胞凋亡减少，滤膜表面存活的细胞较多，EC单层受损减少，EC单层通透性较低。也可能是由于Ang-1促进血小板内皮细胞黏附分子-1(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1)在细胞连接处的聚集，降低E-选择素的表达，降低VE-钙黏附素和PECAM-1的磷酸化，抑制TNF介导的白细胞游出，抑制内皮细胞凋亡[15]，从而降低了高糖环境中EC单层的通透性。但是在40 mmol/L的浓度高糖环境中，Ang-1这种保护作用具有时间依赖性，第3 天时，Ang-高糖组与正常对照组EC单层通透性组间无差异，第5天和第7天Ang-高糖组EC单层通透性居于正常对照组和高糖组之间。

　　葡萄糖能造成EC损伤，使EC单层通透性增高;而Ang-1能对抗葡萄糖的这种生物学作用，但是具有时间依赖性。这种对抗作用有很多的可能机制，都有待于进一步研究。

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